[發明專利]一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法

在審

• 申請號: 201811073516.3
• 申請日: 2018-09-14
• 公開（公告）號: CN109182270A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 張毅;王蕾;趙婧;朱保鋒;彭強
• 申請（專利權）人: 南通市第一人民醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N13/00
• 代理公司: 深圳市興科達知識產權代理有限公司 44260
• 代理人: 許尤慶

1.一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法,其特征在于：包括以下步驟：

A、展神經損傷模型的建立；

B、電針刺激；

C、Western Blot檢測小膠質細胞的M1、M2分子表達；

D、免疫熒光分析；

E、統計分析。

2.根據權利要求1所述的一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法，其特征在于：所述步驟A中具體為：術前12h禁食后注射3％、1mL/kg戊巴比妥鈉靜脈麻醉，將Beagle犬置于手術臺采取側臥位，固定試驗動物頭顱，耳緣牽向尾側固定，麻醉充分開顱后皮瓣翻向外側，經顳肌附著處縱向切開，經顳底入路開顱，骨窗盡量靠近顱底，擴大骨窗范圍從眶后到顴弓前，并沿顳骨窗下緣切開硬腦膜沿斜坡向上外方做一創口3.5cm×3.5cm；向內、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部分暴露深部的展神經；用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經30s后直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經軸突但維持神經鞘膜完性，以犬眼球呈內斜視表明造模成功；分為四組實驗組：假手術組A:僅暴露分離展神經，術中不進行神經損傷處理，縫合切口皮膚，在電針刺激時進行束縛；損傷組B:制作展神經損傷模型，在電針刺激時進行束縛；電針處理組C:Beagle犬展神經損傷模型建立后連續2周進行電針刺激；AM1241組D:展神經損傷+CB2R激動劑AM1241，展神經損傷后連續2周給予溶劑3ml/kg進行腹腔注射。

3.根據權利要求1所述的一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法，其特征在于：所述步驟B中電針處理組C展神經損傷模型制作完成后將2個電極分別置入神經損傷處兩側，向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0mm，間距約4.0mm，縫合切口固定電極，游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術后連續2周給予電針刺激，以局部肌肉輕微跳動為宜，每次持續15min。

4.根據權利要求1所述的一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法，其特征在于：所述步驟C中取上述Beagle犬各分組每組6只，用10％水合氯醛進行深度麻醉后，迅速用手術剪剪下展神經節段，在低溫無菌冰盤上進行操作，分離出少許神經組織置于1ml勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織；加入含PMSF的400μL單去污劑裂解液裂進行勻漿，裂解30min后在4℃下12000rpm離心10min，取上清分裝置于-20℃保存；提取小膠質細胞的總蛋白，通過NanoDrop定量，取40ug蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白以恒定電流30mA，電轉90min轉移到PVDF膜上，TBST洗膜3次，然后5％TBST脫脂奶粉的以60rpm的速度封閉60min，加入一抗4℃冰箱孵育過夜，一抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新雜交袋中，與熒光標記二抗常溫孵育60min，TBST充分清洗后以ECL法顯影并拍照，進行條帶灰度分析。

5.根據權利要求1所述的一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法，其特征在于：所述步驟D中將切片在室溫中放置2h，每個切片晾干后，放入洗片盒內，在PBS中洗滌3次5min，然后放入封片盒中，待水分基本晾干，使用含5％驢血清和0.2％teeen-20PBS封閉，37℃過1h，然后分別加入鼠抗CD11b單克隆抗體鑒定小膠質細胞，兔抗Arginase多克隆抗體鑒定小膠質細胞M2型，4℃過夜后PBS洗滌3次5min，再加入Dylight 594結合熒光標記的抗小鼠IgG和Dylight 488結合熒光標記的抗山羊IgG，4℃避光孵育2h，孵育完畢后使用PBS洗滌3次5min，使用抗熒光衰減避光封片，使用共聚焦顯微鏡觀察并照相。

6.根據權利要求1所述的一種電針誘導展神經M2型小膠質細胞極化方法，其特征在于：所述步驟E中運用SPSS 19.0對研究數據進行統計分析，小膠質細胞M1、M2型標志分子表達水平用均數±標準差表示，組件比較采用t檢驗,計數資料采用χ²檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。