[發明專利]可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410109257.0
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN103966261A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 魏世輝;李玉皓;方楊武
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院;南開大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及斑馬魚模型的制備方法與應用，具體地，涉及可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚及其制備方法和應用。更具體地，本發明涉及制備可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚的方法、可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚及其在髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或再生機制研究，以及篩選用于治療髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或用于髓鞘再生的藥物中的應用。

背景技術

髓鞘是保護、支持和營養軸突的膜性結構，在中樞神經系統，髓鞘由成熟的少突膠質細胞伸出突起包繞軸突形成；而在外周神經系統則由施萬細胞構成。髓鞘的主要功能是起絕緣作用，介導神經沖動的正常、快速傳遞，是神經系統發揮功能的結構基礎。在人類，當髓鞘在遺傳因素和/或外在環境因素作用下受到損傷，即引起以多發性硬化為主要表現的脫髓鞘疾病，除髓鞘脫失外，還出現神經軸突退化，患者出現不同程度的感覺、運動和識別等功能喪失。

截至目前，髓鞘脫失的機制不明，利用動物模型深入研究髓鞘的損傷與再生是一個有效途徑。然而，目前用于髓鞘脫失、髓鞘損傷和/或髓鞘再生機制和相關藥物篩選研究的動物模型，仍有待改進。

發明內容

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

斑馬魚發育快速、胚胎透明，髓鞘結構特征、形成過程及基因表達方式與哺乳動物高度相似，是研究髓鞘損傷與再生的理想動物模型。然而，目前還未見關于髓鞘損傷或髓鞘脫失的斑馬魚模型的報道，利用轉基因技術建立髓鞘損傷或髓鞘脫失的斑馬魚模型是活體研究髓鞘損傷和再生機制的新途徑。

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠有效制備可特異性清除髓鞘組織、獲得髓鞘脫失的轉基因斑馬魚模型的方法。

進而，發明人做了大量工作，最終發現將重組質粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉座酶mRNA共同導入野生型斑馬魚，髓鞘堿性蛋白基因啟動子驅動綠色熒光蛋白，能夠成功構建可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚Tg（mbp:nfsB::EGFP）。進而，在甲硝唑的作用下，可以特異性清除幼魚的少突膠質細胞，使其出現髓鞘脫失的病理改變，并伴有運動功能下降。該轉基因斑馬魚Tg（mbp:nfsB::EGFP）將為深入活體研究髓鞘損傷與再生的調控機制提供有力的動物模型。

根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚的方法。根據本發明的實施例，該方法包括如下步驟：將重組質粒mbp-nfsB-EGFP與Tol2轉座酶mRNA共同導入野生型斑馬魚中；以及培養獲得穩定遺傳的轉基因斑馬魚品系，所述穩定遺傳的轉基因斑馬魚品系即為可特異性清除髓鞘組織的轉基因斑馬魚，其中，所述重組質粒mbp-nfsB-EGFP中攜帶的mbp基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具體地，所述mbp基因（即髓鞘堿性蛋白基因）啟動子的核苷酸序列如下所示：

ataataacaa tcccaactcc atgttgcaga tgctgagatg tgactactgc aaatgaacac60

ggtgtgatat tgatgccgaa acaatatatt gtgcagccct acaataaacc ttggattaaa120

gtgcatattg acggtcctat gaatttactt tagatgatta catttcaaat ggaatgacag180

aaatatttca gattttgtta caaataatga ataataaata taaattaata aactcaatgt240

ctgattagta ctttgcactg ctacagtaat acttaatttg ttcagattta aaggtgattt300

ttcaatattt agattttttt aaaccctcca tgttttcaaa tatttgtcca tgctaacaac360

ccatgcaatg gaaatcattg attagatgga aatccatcta atcaatggat tatgtataaa420

gaaataaggt ggtttagtat tggggtgaat taaacattta tcgtcatttt tatcacagtt480

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