[發明專利]內生生防菌株及其制成的生防菌劑的制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410106089.X
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN104017748B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 馬耀華;譚小艷
• 申請（專利權）人: 棗莊學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種內生生防菌株，所述菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），己于2014年1月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC?NO.8812。

2.一種根據權利要求1所述菌株的制備方法，其特征是：第一步，內生生防菌株的分離和純化，采集健康的石榴葉片稱取3.0?g，用無菌水沖洗4~5次，無菌剪刀剪成4~5?mm見方的小塊后，依次用75%的酒精浸泡5?s，0.1?%的升汞浸泡50?s，無菌水沖洗3次，然后加30?mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1?g/mL，取上清液1?mL進行梯度稀釋至10^-5，從10^-3、10^-4、10^-5稀釋懸液中各取0.2?mL涂布平板，以最后一次沖洗液0.2?mL涂布平板進行無菌檢驗，每處理3個重復；在37℃恒溫培養箱中倒置培養24~48?h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養基上采用平板劃線法進行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基，37℃培養24?h，4℃冰箱保存備用；第二步，內生生防菌株的篩選，首先將石榴腐爛病菌在馬鈴薯葡萄糖培養基平板上28℃培養至產生孢子，用接種環挑取少量的病原菌孢子點接到馬鈴薯葡萄糖培養基平板中央，在距平板中央3?cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內生菌株，以只接石榴腐爛病菌為對照，28?℃恒溫培養箱中培養，待對照中病菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小，篩選出抑菌效果較好的菌株；第三步，將篩選出的內生生防菌株進行保存，第一種保存方法，將選擇培養的內生菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨斜面上，培養24?h后置于4℃冰箱保存，半年轉管一次防止培養基干涸菌種死亡，供臨時使用，第二種保存方法為甘油保存：將內生生防菌株用無菌水懸浮，充分混勻制成菌懸液，取20?%的滅菌甘油與菌懸液在渦旋震蕩器上充分混勻轉入無菌的1.5?mL?EP管中，于﹣80?℃冷凍長期保存。

3.根據權利要求2所述菌株的制備方法，其特征是：所述滅菌甘油與菌懸液的體積比為2：1。

4.一種根據權利要求1所述的內生生防菌株生防菌劑，其特征是：生防菌劑濃度為1×10^8?cfu/mL的內生生防菌株細胞懸液。

5.一種根據權利要求4所述生防菌劑的制備方法，其特征是：挑取活化的內生生防菌株少許，接種到10?mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37?℃，180?r/min搖床培養24?h，作為種子液；將種子液按1%（v/v）的比例接種于含200?mL?牛肉膏蛋白胨液體培養基的1L三角瓶中，37?℃，180?r/min搖床培養48?h，得到發酵液，2?500?r/min離心6?min，收集菌體用無菌水洗滌，用清水配成濃度為1×10^8?cfu/mL的內生生防菌株細胞懸液，即為內生生防菌株生防菌劑。

6.一種根據權利要求4所述的生防菌劑在防治石榴貯藏期果實腐爛病的應用，其特征是：將石榴果實用清水洗凈、風干，將石榴果實浸入生防菌劑中10?min，取出后瀝干萼筒內的殘留溶液并預冷至5℃左右，再用0.?025~0.03?mm?厚的聚乙烯袋單果包裝，裝箱入庫，保存溫度為4~6℃，相對濕度為90%。