[發明專利]豬細環病毒I型和II型的雙重實時熒光PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201410105912.5
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN103882149A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 楊春華;孫思揚;胡婷;石磊
• 申請（專利權）人: 江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤;彭家恩

技術領域

本申請涉及分子檢測領域，特別是涉及一種豬細環病毒I型和II型的雙重實時熒光PCR檢測方法。

背景技術

TTV是一種無包被的單股環狀負義的DNA病毒，由于最初是在肝炎患者中分離得到，猜測與肝炎有關，受到醫學領域的廣泛關注。豬源TTV的中文名字被定義為豬細環病毒（Torque?Teno?Sus?Virus，TTSuV）。流行病學研究發現，TTV通過輸血、性行為、糞-口途徑等方式進行傳播，同時血液、唾液、糞便、乳汁、膽汁均可帶毒，通過不同人群的TTV的感染率的研究結果顯示：一般人群的感染率多在10%以上，呈無癥狀攜帶。除了人可感染TTV以外，貓、狗、豬、牛、雞、羊、老鼠等動物也是TTV的宿主。Okamota?H等根據人TTV非編碼區的DNA序列設計引物，擴增了豬、狗和貓血清中的TTV基因片段，發現在這幾個不同種屬中TTV基因序列和長度差異極大，核酸同源性較小，具有物種專一性。美國學者Leary等應用巢式PCR方法從豬血清中檢測到TTV（Sd-TTV31），基因組長度為2878bp。2005年，Niel?C等利用多重引導滾環式擴增法(Multiply?primed?rolling-circle?amplification,RCA)檢測到豬TTV的另一種亞型：Sd-TTV2p，基因組長度為2735bp，與之前發現的Sd-TTV31的同源性非常低，只有45.1%，于是將TTSuV分為兩種基因型，TTSuV1型以Sd-TTV31為原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p為原型。目前，統一的將TTSuV1型稱為豬細環病毒I型（簡寫TTSuV?I），TTSuV2型稱為豬細環病毒II型（簡寫TTSuV?II）。

TTSuV和人TTV基因組結構組成相似，由非編區(UTR)和編碼區兩部分組成，非編區由一個富含GC的區域、一個啟動子和一個轉錄增強子組成，兩末端的GC區域形成具莖環的二級結構，在病毒復制中可能有重要調控作用；TTV編碼區包含3個開放閱讀框(ORF1～ORF3)、一個PolyA和一個TATA盒，變異率較高。ORF1的N端富含精氨酸(Arg)蛋白質，該蛋白質有可能是復制相關的蛋白-Rep蛋白；ORF2編碼與復制相關的蛋白；ORF3編碼結合蛋白，分為兩段，其中隔著一個類似于真核生物編碼區中內含子的序列。編碼區轉錄時產生3種不同的mRNA，能翻譯表達6種不同的蛋白。兩種基因型TTV編碼蛋白具有相似的序列和功能。

國外已有許多相關報道，表明TTSuV的感染在全球分布很廣且其流行率很高。Segalés等對西班牙豬場1985-2005年采集的162份豬血清進行追溯性調查，結果在所有年份均檢出TTSuV病毒，TTSuV1和TTSuV2的感染率分別是33.3%（54/162）和55.6%(90/162)，兩種基因型共感染率為23.5%（38/162），證實了TTSuV的感染早在最初發現這病毒(Leary?et?al.,1999)的14年前就存在了。

近年來，國內也陸續開展了對TTSuV感染情況的研究。這些研究顯示，TTSuV在豬群中的感染在國內外已經非常普遍，是一個不容忽視的新病原。而目前對TTSuV的了解還非常有限，綜合國內外檢測TTSuV的方法主要有血清免疫學法和分子生物學法,血清免疫學法有酶聯免疫吸附(ELISA)法，ELISA是用于疫病檢測和監控的常用方法，但由于TTSuV具有高度基因變異性，不同基因亞型抗體間存在交叉反應，用它對基因變異進行分析時準確率較低，不能完全反映體內基因變異情況，更重要的是ELISA法的漏檢率較高。除此之外，由于感染時間較短而尚未產生抗體也可造成ELISA實驗結果的假陰性。

目前用于TTSuV檢測的分子生物學方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滾環擴增等方法。常規PCR和套式PCR方法均根據目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非編碼區來設計引物，對核酸進行檢測。滾環擴增法是以任意的寡核苷酸作為引物，在恒溫下以滾環擴增待測環狀DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度較低，用普通PCR一輪難以擴增出目的片段，需加大循環數，但這樣會使引物非特異性結合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了單次擴增“平臺期效應”的限制且保證了反應的特異性，但是需要進行第二次PCR，引起交叉污染的幾率較大。普通PCR敏感性較差，巢氏PCR、半巢氏PCR和滾環擴增耗時較長，且這些傳統的PCR技術只能對基因的檢測做定性分析，無法精確的定量所檢測出的基因數量，大大制約了PCR技術的應用。