[發明專利]重組人DKK1多表位核酸疫苗、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201410101801.7
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103910801A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 袁慧慧;張曉清;趙文明;李慎濤
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K48/00;A61K39/00;A61P19/02;A61P29/00;C12N15/85;C12N1/21;C12N5/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體地說，涉及重組人DKK1多表位核酸疫苗、其制備方法及應用。

背景技術

類風濕關節炎（Rheumatoid?arthritis,RA）是一種慢性系統性自身免疫性疾病，以侵蝕性滑膜炎及對稱性、破壞性關節病變為主要病理學特征。最終可導致患者關節畸形和功能喪失，是造成人群勞動力喪失與致殘的主要病因之一，給個人和社會帶來沉重的負擔。

由RA慢性、持續性炎癥最終導致骨侵蝕的機制尚不清楚。因此，研究RA發病及骨損害的分子機制至關重要。近年來，越來越多的研究表明，Wnt信號通路在RA發病過程中起重要作用。Wnt信號可直接影響多潛能的前體細胞向軟骨細胞和成骨細胞(Osteoblast,OB)分化的過程，并且通過上調OPG/RANKL/RANK系統中OPG/RANKL的比率影響破骨細胞(Osteoclast,OC)的發育成熟。目前，Wnt信號通路主要由兩條途徑調節骨代謝：（1）經典途徑：Wnt/β-catenin信號通路，主要通過富集細胞內的β-catenin，進而促進β-catenin進入細胞核，調控下游成骨細胞靶基因的表達，促進成骨細胞分泌I型膠原而加速骨組織礦化，促進間充質前體和骨-軟骨細胞前體增殖分化為成骨細胞和軟骨細胞，延長成骨細胞的存活時間；并且抑制成骨細胞和破骨細胞的偶聯，調節骨保護素（osteoprtegerin,OPG）和核因子-κB受體活化因子配體（Receptor?activator?of?nuclear?factor-κB?ligand,RANKL）的表達，影響骨吸收；使包埋在骨基質中的骨細胞最終分化為成骨細胞，并改變OB/OC的胞外基質以及在骨表面的定位，刺激骨折修復和影響骨重塑。（2）旁路途經：Wnt/Ca²⁺信號通路，主要通過調節G蛋白激活胞質中多種對Ca²⁺敏感的酶，包括磷脂酶C（phospholipase?C，PLC），蛋白激酶C（protein?kinase?C，PKC）和鈣離子-鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium-calmodulin?dependent?kinase?II，CamKII）等，進而調節細胞內Ca²⁺的釋放；Wnt/PCP(Planar?Cell?Polarity)信號通路，主要通過小G蛋白RhoA和Cdc42等激活JNK（Jun?N-terminal?kinase），促進軟骨細胞的去分化。目前為止，這些途徑在骨和骨細胞的作用尚不很清楚。

DKK1是Wnt信號通路的抑制因子，屬于DKK家族中的一員。DKK家族是在進化過程中很保守的一個基因家族，在脊椎動物中包括DKK1、2、3、4四個成員，都是分泌型糖蛋白，其中DKK1、2、4可以參與調控Wnt信號通路,尤其以DKK1抑制Wnt通路而介導骨破壞的途徑及其拮抗劑的研究最為重視。人類DKK1基因位于10號染色體10q11.2，其編碼的分泌性糖蛋白由266個氨基酸組成，結構上包括三個部分：（1）一個N端的信號序列，介導DKK1肽鏈穿越粗面內質網并分泌至細胞外。（2）兩個保守的半胱氨酸富集區域。（3）靠近蛋白質C端的N-糖基化位點。DKK1是成骨細胞生長和分化的重要調節因子，DKK1與Wnt蛋白競爭性結合膜受體LRP5/6，并與膜受體Kremen結合，形成DKK1-LRP-Kremen復合體，經由吞飲作用進入胞漿并被溶酶體分解，從而減少了Wnt膜表面受體的數量，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，下調胞漿β-catenin水平，抑制成骨細胞生長和分化的轉錄因子，使成骨細胞數量減少、活性降低、壽命縮短。同時，成骨細胞Wnt/β-catenin通路被阻斷后，下調骨保護素的表達水平，從而促進破骨細胞的分化。可見，過表達的DKK1可抑制骨的形成并促進骨的吸收。研究表明，RA患者的血清和滑液中DKK1水平升高，并與疾病嚴重程度呈正相關，是介導RA骨損傷的重要致病因子。應用抗DKK1抗體治療絕經后骨質疏松，可增加成骨細胞數量、提高血清骨鈣素水平，增加小梁骨體積，促進膜內成骨，減少骨吸收。

目前臨床上治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥（non-steroidal?anti-inflammatory?drugs,NSAIDs）、改善病情抗風濕藥（disease?modifying?antirheumatic?drug,DMARDs）及生物制劑等。這些藥物在一定程度上緩解了RA病情，但并不能完全抑制骨結構破壞的放射學進展，因此開發抑制RA骨破壞的藥物顯得尤為重要。而DKK1作為Wnt信號通路的抑制因子在RA發病機制及骨侵蝕中起關鍵作用，可能成為RA治療新的分子靶點。