[發(fā)明專利]一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒及其制備和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410101308.5
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103834741A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 祝潔;張勇
• 申請（專利權(quán)）人: 四川萬可泰生物技術(shù)有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 謝敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的引物、試劑盒及其制備和檢測方法，具體設計一種引物，配置成一個試劑盒，提供一種無創(chuàng)、簡單、快速、靈敏的幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒及檢測方法，為檢測人和動物幽門螺桿菌感染提供方法和試劑。

背景技術(shù)

1983年幽門螺旋桿菌（Helicobacter?pylori?簡稱Hp）被澳大利亞的Warren和Warshail發(fā)現(xiàn)，已被確認為最常見的慢性感染性疾病的病原之一。現(xiàn)階段臨床檢測?Hp主要分為侵入性和非侵入性兩大類，侵入性檢測一般為胃鏡檢測和血清抗體檢測；非侵入性檢測為同位素C標記呼吸實驗和糞幽門螺桿菌抗原檢測。這些檢測方法雖為臨床常規(guī)檢測方法，但上述方法都不定量，同時檢測不方便，更重要的是因敏感性不高，檢測結(jié)果不能及時反映幽門螺桿菌的感染狀況。另外，這些檢測需要采血或下胃鏡取胃組織，或口服放射性標記物，對人體或環(huán)境有一定的傷害。多聚酶鏈式式反應（PCR）技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了檢測的靈敏度和準確性，理論上，只要樣本中有1個被檢物質(zhì)的基因，就可以用PCR檢測方法檢測出來。PCR方法是分子診斷的一種典型的診斷方法，其具有檢測靈敏度高，取材方便，檢測高通量等優(yōu)點。大量研究顯示。幽門螺桿菌進入和排出人或動物體的唯一途徑是糞-口，因此在疑似幽門螺桿菌感染者的糞便樣本和口腔樣本中一定含有幽門螺桿菌核酸分子，用特異的PCR引物，通過適當?shù)脑噭┡渲疲梢杂肞CR技術(shù)無創(chuàng)傷的從唾液或糞便樣本中快速檢測幽門螺桿菌的感染，這種新型的檢測方法對診斷幽門螺桿菌有著非常重要的意義。

目前，已有的Hp檢測方法通常為侵入性的，如組織切片染色檢查是取胃粘膜標本切片或者涂片染色鏡檢查Hp，再如組織切片免疫組織化學染色檢查是將組織切面的免疫組織化學染色對Hp進行檢測，且一般不能作為常規(guī)的診斷手段，這些檢測的介質(zhì)都需要經(jīng)過復雜的采集制作過程，比如為提取DNA需要裂解液而對人的胃造成一定的損傷，這樣就會對人力物力和檢測時間都不具有成本節(jié)約性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了臨床現(xiàn)有幽門螺桿菌檢測技術(shù)的不足，提供一種無創(chuàng)、簡單、快速、靈敏的幽門螺桿菌基因檢測引物及試劑盒制備和檢測方法。該試劑盒制備方法和操作步驟簡單，采用唾液或糞便為檢測樣本，無需特殊處理，可快速、定性和定量檢測幽門螺桿菌的感染狀況。取唾液或糞便樣本無創(chuàng)、方便；用特異引物PCR擴增靈敏度高，特異性好；用特殊的反應條件，無需繁雜的操作過程，降低病人檢測中的痛苦，提高了檢測的靈敏度和特異性，。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

設計篩選了一種特異地用于無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的引物，所述引物為5'-?TTGGGATAGCCATTGGAAACG?-3'

3'-?GTTCCGATACTGCCCATAGGC?-5'。

建立了該引物的擴增方法，包括以下兩個步驟：

a、???????????熔鏈：在92-96℃下進行8-10s；

b、??????????退火延伸：在56-66℃下進行25-30s，退火延伸是在同一個溫度條件下進行的，因此不需要將熔煉后的產(chǎn)物經(jīng)過2次降溫，而直接將產(chǎn)物降溫到延伸時需要的溫度，省去了一次降溫步驟，而節(jié)約了操作工序和操作時間，同時節(jié)約了成本；

該兩個步驟按順序循環(huán)30cycle。

退火溫度為62℃。

一種用于無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒，包括所述的引物(R1)，還包括R2試劑、R3試劑，所述R2試劑為PCR?Taq酶預混合液（如：TAKARA?的SYBR?Green?Taq?MIX等），所述R3試劑為無菌蒸餾水。

該無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒配置和操作包括以下步驟：

（1）?????????????無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒配制：引物R1用無菌蒸餾水稀釋到終濃度8-10μM，?SYBR?Green?Taq?MIX為R2試劑；滅菌的蒸餾水作為R3試劑）。將所述試劑組分別包裝或預混合包裝，如PCR擴增管分別預裝R1或R2或R3，配置成試劑盒，又如PCR擴增管預裝R1、R2和R3的混合物。

（2）?????????????PCR模板：可取糞便樣品或口腔樣本，水煮沸離心后即可作檢樣獲得（模板）；

（3）?????????????試劑盒操作：將一定量的PCR模板（糞或唾液樣品）加入預裝有試劑的PCR擴增管中，按操作參數(shù)設置，在PCR擴增儀上反應，得到擴增產(chǎn)物；

（4）?????????????檢測：