[發明專利]一種檢測α2珠蛋白基因點突變的巢式非對稱PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201410098630.7
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103898213A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 周萬軍;熊符;徐湘民
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于分子檢測領域，具體涉及一種巢式非對稱PCR解鏈熒光分析檢測α2珠蛋白基因點突變試劑盒。

背景技術

人類α-珠蛋白基因簇位于16號染色體上，表達α珠蛋白鏈，與β珠蛋白鏈結合，形成具有功能血紅蛋白四聚體。正常情況下，人類珠蛋白基因所表達的α類和β類珠蛋白鏈比例適當（1:1），當α珠蛋白基因缺陷，導致α鏈合成減少而β鏈相對過剩，即可導致α-地中海貧血疾病。地中海貧血（簡稱“地貧”）是全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳病之一，主要集中在地中海沿岸國家、東南亞、少數非洲地區和我國南方，保守估計全世界攜帶者近2億人。臨床上常見α-地貧和β-地貧。但α-地貧的人群攜帶率遠高于β-地貧。此病無有效治療手段，應用相應分析技術通過人群篩查及產前診斷阻止重癥患兒出生是國內外公認的首選預防措施。導致α鏈合成減少的根本原因是α珠蛋白基因突變，包含大片段缺失和點突變兩種類型，其中由α珠蛋白基因點突變而導致的α-地貧又稱為α-地貧基因點突變或非缺失型α-地貧。

正常人每條16號染色體上有兩個高度同源的α珠蛋白基因，即α2和α1，正常情況下，α2較α1功能更強，α2約占基因表達量的2/3，α1約占基因表達量的1/3。目前的研究及分子流行病學調查結果顯示，α-地貧基因點突變主要發生在功能較強的α2珠蛋白基因上，如中國人群中常見的WS、QS、CS，以及次常見的CD30、CD31等突變類型。

當前α-地貧基因點突變的分子診斷和產前診斷策略，是采用相應的技術方法，分析α珠蛋白基因是否存在點突變。檢測技術的發展歷程中，擴增阻礙突變系統PCR（ARMS-PCR），是分別針對每一個突變位點，采用兩個PCR反應管逐一檢測，操作繁瑣、費時費力，并且這種技術的檢測條件難以控制，易于出現假陰性和假陽性結果。隨后采用的等位基因特異性寡核苷酸雜交法（ASO），大大減少了假陰性和假陽性結果，但仍需逐一檢測每一個突變位點，檢測通量低，費時費力。當前在臨床上常規使用的反向點雜交法（RDB），可同時檢測WS、QS和CS三種突變類型，在一定程度上減小了勞動強度，增加了檢測通量，可是，此技術的操作流程依然繁瑣，先PCR擴增α2珠蛋白基因，然后再通過變性、雜交、洗膜、顯色等一系列操作再觀察檢測結果，同時，PCR產物的開蓋操作也大大增加了實驗室攜帶污染的風險。DNA測序分析也是當前可選的一種α珠蛋白基因點突變檢測方案，此技術操作過程是先PCR擴增，再PCR產物純化、測序PCR反應、測序儀上毛細管電泳分析等，同樣存在操作繁瑣、攜帶污染等問題。總的來說，目前使用α2珠蛋白基因點突變檢測方法，檢測成本高、工作量大、操作繁瑣、檢測通量小，難以實現自動化和標準化，且存在PCR產物攜帶污染等技術局限，不能滿足當前α-地貧的大規模人群篩查和臨床常規分子診斷需要。

隨著目前以降低地貧患兒出生率為目標的預防計劃與措施的相繼實施，以及地貧分子機制及分子流行病學的深入研究，準確可靠、簡單實用、能實現自動化和標準化、適合大規模人群篩查和常規分子診斷的高通量檢測技術與方法，是這些項目實施的技術支撐條件，更是當前地中海貧血分子診斷的迫切需要。針對上述α2珠蛋白基因點突變檢測分析的技術局限，研發相應的技術方法，一次性閉管操作以防止PCR產物攜帶污染，單反應管檢測多種突變類型以提高檢測通量且簡化操作強度，儀器自動檢測分析以實現自動和標準化，是目前方法學研究的主要方向。

發明內容

為了解決現有技術中所存在的不足，本發明的目的在于提供一種可以一次性閉管檢測α2珠蛋白基因中WS、QS、CS、CD30、CD31五個點突變類型的檢測試劑盒。

本發明所采取的技術方案是：

用于檢測α2珠蛋白基因點突變的巢式非對稱熒光PCR試劑盒，所述試劑盒包括：

（1）用于特異性擴增α2珠蛋白全序列的引物對；

（2）用于擴增CD30/CD31目的片段DNA單鏈的引物；

（3）用于擴增WS/QS/CS目的片段DNA單鏈的引物；

（4）特異性檢測α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五個點突變序列的野生型及突變型的熒光探針，以及相對應的淬滅探針，通過在熒光探針上修飾不同的熒光信號和/或不同的解鏈溫度來區分WS、QS、CS、CD30、CD31五個點突變序列的野生型及突變型。

所述用于特異性擴增α2珠蛋白全序列的引物對的Tm值比其他引物或熒光探針、淬滅探針的Tm值高5-10℃。

作為優選的，所述用于特異性擴增α2珠蛋白全序列的引物對的Tm值≥72℃。