[發明專利]一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201410098187.3
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103830746A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 嵇辛勤;傅心亮;文明;阮涌
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/102;A61P31/04;C12N15/79;C12N15/31
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及其制備方法。

背景技術

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella?anatipestifer，RA）引起的鴨病稱為鴨傳染性漿膜炎（infectious?serositis），是感染鴨、鵝等多種禽類的一種急性或慢性接觸性性傳染病，鵝感染后曾被稱為鵝流感或鵝滲出性敗血癥，具有較高的發病率和死亡率。鴨疫里默氏桿菌病在我國普遍流行，幾乎遍布了所有養鴨地區，給養鴨業的發展造成了極大的損失，特別是對西部地區蓬勃興起的養鴨業帶來了嚴峻的威脅。

目前，我國對鴨疫里默氏桿菌病的控制主要采取藥物為主，因其具有多種血清型，而各種不同血清之間無交叉保護性，故全國沒有的統一的滅活疫苗，針對地區研發出的各種疫苗也只能對相應的地區有局部有效果，都存在一定的不足，滅活疫苗免疫效果不佳，需用劑量較大，只能提供短暫保護。而DNA疫苗又稱裸疫苗，是繼滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程重組蛋白疫苗之后的第三代疫苗，目前已用于HIV、流感病毒、惡性瘧原蟲等多種病原體感染性疾病的防控，并取得了積極的進展。

據研究資料顯示，鴨疫里默氏桿菌病毒OmpA基因所編碼的OmpA蛋白是目前各地區各血清特異性強的結構蛋白，具有較強的抗原性，能誘導鴨細胞免疫和體液免疫應答反應，產生特異性中和抗體和各種細胞因子，在鴨疫里默氏桿菌病的預防與控制上發揮重要作用。關于基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗少見報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，提供一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及制備方法，該疫苗能誘導鴨產生良好的體液免疫應答，且不引起鴨產生不良反應，具有良好的生物安全性。

本發明的技術內容：

一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，含鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的真核表達質粒pcDNA3.1(+)-OmpA，質粒濃度為2mg~5mg/mL，該真核表達質粒含有鴨疫里默氏桿菌OmpA的全基因編碼序列，該基因的長度為1164個核苷酸，類型為核苷酸，全長為編碼區。

一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟：

第一，培養鴨疫里默氏桿菌貴州三穗分離株，采用DNA提取試劑盒或煮沸法提取細菌DNA，進行PCR目的基因擴增；

第二，將獲得的目的基因片段連接于pMD-18T載體，構建pMD-18T-OmpA，再轉入大腸桿菌DH5α中；

第三，采用PCR方法從pMD-18T-OmpA擴增出OmpA基因，用HindⅢ＋BamHⅠ進行酶切，同法處理真核表達載體pcDNA3.1(+)，然后電泳分離和分別回收目的基因；

第四，采用T_4?DNA連接酶將鴨疫里默氏桿OmpA基因插入真核表達質粒pcDNA3.1(+)中，轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選，挑取可疑菌落于LB液體培養基于36℃~38℃培養12~18h，收集菌液采用DNA提取試劑盒提取質粒，用PCR和雙酶切進行鑒定；

第五，取鑒定為陽性重組質粒的大腸桿菌DH5α，于LB液體培養基36℃~38℃培養12~18h后，采用大劑量質粒提取試劑盒提取得到pcDNA3.1(+)-OmpA，即為基于鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗。

本發明有益效果：本發明方法適用于鴨的免疫接種，防制鴨疫里默氏桿菌病的發生與流行，同時具有良好的經濟效益和生態效益。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果：

(1)?免疫效果良好：本發明所采用真核表達載體pcDNA3.1(+)構建的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，肌肉注射動物后能誘導鴨產生良好的體液免疫應答，且真核表達質粒不易降解，性能穩定，免疫效果持續時間長。

(2)?制備成本較低：本發明的DNA疫苗在需要時，只需將含重組質粒pcDNA3.1(+)-OmpA的大腸桿菌DH5α進行大量培養后，提取重組質粒pcDNA3.1(+)-OmpA即可。

(3)?免疫接種方便：本發明的DNA疫苗采用肌肉注射進行接種，操作方便，不像其他滅活疫苗要求皮內或皮下注射。

(4)?安全無副作用：本發明的DNA疫苗不會引起毒力增強或導致基因整合，也不會引起鴨發生其他癥狀。

附圖說明

圖1為本發明的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備流程圖。

具體實施方式