[發(fā)明專利]鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410088918.6
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103820395A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于圣青;侯灣灣;王少輝;王小蘭;韓先干;丁鏟;王權(quán);蔣蔚;岳嘉蘋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 上海百一領(lǐng)御專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31243
• 代理人: 馬育麟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及其在免疫檢測試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella?anatipestifer,RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的禽類接觸性傳染病，主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，發(fā)病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成的經(jīng)濟損失重大，是目前危害禽類養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一。鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜，迄今為止，已公認(rèn)的有21個血清型（l～21型），各血清型之間缺乏有效的交叉保護。我國該病的發(fā)展更是越來越復(fù)雜而且呈動態(tài)變化，這使得對該病的免疫預(yù)防與診斷困難極大。

臨床上通常以病例特征性的癥狀和解剖的特征病變進行診斷，但是該病與禽致病性大腸桿菌病和禽沙門氏菌病在臨床癥狀和病理變化上很相似，很難進行鑒別診斷。病原菌的分離鑒定為該病的確診手段，但是其工作程序較為繁瑣。目前檢測鴨疫里默氏桿菌的血清學(xué)方法有間接血凝試驗，平板凝集，試管凝集和瓊脂擴散試驗等。用裂解的全菌蛋白^[1]、提純的脂多糖^[2]和外膜蛋白^[3]作為包被抗原建立的ELISA方法能特異性檢測出鴨疫里默氏桿菌抗體。檢測鴨疫里默氏桿菌的分子生物學(xué)方法主要有基于該菌16S?rRNA^[4]和OmpA^[5]的PCR方法，基于莢膜多糖基因序列的real-time?PCR^[6]以及基于groEL的LAMP^[7]方法等。但是這些方法都存在過程繁瑣、耗時長、不適合野外操作等缺點，因此需要建立一種快速靈敏特異性強的方法以滿足臨床快速檢測的需求。

膠體金免疫層析法（Immunochromatography?Assay）始于上世紀(jì)90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它是免疫親和技術(shù)、印跡技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)的組合。目前已得到了迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于免疫組織（或細(xì)胞）化學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具有操作簡單、檢測快速靈敏、結(jié)果清楚、易于保存和判斷，且無需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。

本發(fā)明研究人員的前期研究表明GroEL蛋白是一種免疫原性蛋白，且在血清1、2、10型菌株中保守型良好^[8]。GroEL是分子伴侶家族HSP60成員之一，為可溶性蛋白，單體分子量為60kDa左右，兩個由七個亞基組成的環(huán)疊加在一起形成十四聚體。GroEL蛋白具有重要的生理功能，在新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝以及變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過程中起重要作用。

本發(fā)明利用GroEL蛋白的單克隆抗體建立針對抗原檢測的免疫膠體金檢測試劑盒可滿足現(xiàn)場和生產(chǎn)實踐的需求，對該病的診斷提供快速有效的工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能分泌鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體。

本發(fā)明的再一目的在于提供含有該單克隆抗體的免疫檢測試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述分泌針對鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1G2F10（鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株），已于2014年1月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），其保藏編號為CGMCC8778。

本發(fā)明還提供一種由所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體。

本發(fā)明所述的鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體具有良好的特異性，與禽致病性大腸桿菌、沙門氏菌和禽巴氏桿菌均無交叉反應(yīng)性，而與鴨疫里默氏桿菌血清1、2、10型菌株均有良好的反應(yīng)性。

本發(fā)明還提供包含所述的鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體的免疫檢測試劑盒。

本發(fā)明所述鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體在制備檢測鴨疫里默氏桿菌的免疫檢測試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用純化鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維素膜（NC膜），結(jié)合膠體金標(biāo)記的鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗夾心法的原理檢測標(biāo)本中鴨疫里默氏桿菌。