[發明專利]轉錄因子結合位點調節啟動子強度的方法

無效

• 申請號: 201410088336.8
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103898113A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 李春;李哲;張根林
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及轉錄因子結合位點調節啟動子強度的方法，屬于生物化工領域。?

背景技術

隨著代謝工程的發展以及合成生物學的興起，無論是在宿主微生物中移植外源代謝途徑還是延長宿主微生物的分支代謝途徑，都涉及到多酶催化反應，大部分的研究主要集中于選擇合適的酶來催化反應，這主要是因為酶是代謝工程中的首要決定因素，并且酶的來源十分廣泛，而且在不同的宿主中表達可能會產生不同的催化特性。但是，選擇合適的啟動子對于代謝工程同樣十分重要，這不僅是由于基因的轉錄水平是由啟動子決定的，而且啟動子易于控制調節基因的轉錄。?

啟動子的選擇在代謝工程的設計中是十分重要的組成部分。在大腸桿菌中，通過利用強啟動子對其進行代謝途徑的改造，成功的在大腸桿菌中生產出1,4-丁二醇、1-丁醇、異丁醇和聚乳酸。在鏈霉菌中，利用不同的啟動子激活其細胞內沉默的基因簇成功的合成出新的抗生素。在釀酒酵母細胞中，利用強組成型啟動子過量表達磷酸戊糖途徑的相關酶類，使釀酒酵母具有代謝木糖的能力。另外，通過多基因啟動子穿梭技術提高了釀酒酵母利用木糖生產乙醇的效率，在引入大腸桿菌的阿拉伯糖降解途徑后，使其也可以利用阿拉伯糖進行代謝發酵生產乙醇。半乳糖誘導型啟動子在代謝工程中的應用也十分廣泛，其中應用最為成功的是利用其在釀酒酵母中高效生產青蒿酸。?

在代謝工程的實際應用中發現，啟動子并不是越強越好，平衡的代謝流才最有利于目標產物的合成，因此不同強度的啟動子就顯得十分必要，在現有的啟動子基礎上對其進行改造可以滿足這種需求，而主要的改造的方法有以下幾種。1）Ep-PCR，Ep-PCR可以在DNA序列中隨機的引入突變，在整個啟動子的序列內引入隨機突變可以建立數目相當的突變啟動子文庫，在合適的篩選方法下，可以得到強度不同的啟動子。通過對釀酒酵母組成型啟動子進行隨機突變得到了一個強度范圍差別15倍的突變啟動子庫。2）啟動子間隔區的飽和突變，對啟動子的間隔區進行飽和突變是一種十分有效的方法用于改變啟動子的結構從而構建合成啟動子文庫。通過對大腸桿菌啟動子的-35和-10保守區之間和周圍的間隔區進行飽和突變可以得到強度不同的啟動子。在乳酸鏈球菌的啟動子的間隔區進行飽和突變后可以得到一個強度范圍在400倍的人工啟動子文庫。3）啟動子的雜交，啟動子雜交的主要目的是將真核生物啟動子的增強組件與核心啟動子進行融合從而可以理性的增強啟動子的轉錄水平并調控啟動子的功能。通過這種啟動子雜交的方式構建可以得到啟動子強度差異90倍的啟動子文庫。這種方法除了可以應用在組成型啟動子上外，還可以將誘導型啟動子的調節元件也進行融合，使組成型的啟動子改造成誘導型的啟動子。?

在啟動子的序列內存在一些轉錄因子結合位點，細胞內的轉錄因子通過這些結合位點可以與啟動子發生相互作用，增強啟動子的強度。通過將這些轉錄因子結合位點插入到啟動子?中可以人為的調節啟動子的強度，為啟動子強度的調控提供技術方法。?

發明內容

本發明的目的是為解決基因表達過程中啟動子強度難以調節的問題，提供一種利用轉錄因子結合位點調節啟動子強度的方法。?

為達到上述目的，本發明的技術方案提供一種利用轉錄因子結合位點調節啟動子強度的方法，從釀酒酵母啟動子FBA1p中克隆得到一段含有轉錄因子Rap1、Gcr1和Gcr2結合位點的核酸序列，通過OE-PCR的方法將這段序列與啟動子融合可以調節啟動子的強度。?

本發明的調節啟動子強度的方法，具有以下優點：?

1、本發明創建的方法可以有效的調節啟動子的強度，有利于外源基因在代謝工程中的表達。?

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明的具體實施方式進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。?

實施例1：轉錄因子結合位點增強啟動子ENO2p的強度?

1、從GenBank中查詢釀酒酵母基因組中的XI號染色體（GenBank?ID:BK006944.2），克隆出FBA1基因（GenBank?ID:DAA09097.1）上游-495到-360區域的序列，此序列為含有轉錄因子Rap1、Gcr1和Gcr2結合位點的核酸序列。?

引物序列為：?

引物1：5’>CACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGAATGTGTGGG?TCATTACGTA<3’，下劃線序列為與所用的線性質粒pRS41H的重疊序列。?