[發(fā)明專利]一種利用蛋白支架提高大腸桿菌中異戊二烯合成的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410088310.3
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103898149A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李春;屈虹男;李哲;王翠薇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P5/02;C12R1/125;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高大腸桿菌中異戊二烯合成的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)

異戊二烯即2-甲基-1，3-丁二烯，是一種共軛二烯烴，作為一種重要的五碳平臺化合物用途十分廣泛，主要用于橡膠工業(yè)（如：輪胎，粘合劑的生產(chǎn)），是合成橡膠（SR）的重要單體，其用量約占異戊二烯總產(chǎn)量的95%，主要用于合成異戊橡膠（IR）以及丁基橡膠（IIR），其次，在精細(xì)化工領(lǐng)域還可以作為合成香精香料、維生素E、農(nóng)藥的原料，也可用于合成樹脂、液體聚異戊二烯橡膠等，除此之外，生物來源的異戊二烯還可以加工成航空燃料，高分子材料等，在天然產(chǎn)物方面，異戊二烯也是合成萜類化合物的前體物質(zhì)。

工業(yè)上生產(chǎn)異戊二烯的方法有很多種，目前異戊二烯的生產(chǎn)方法主要有C5餾分萃取蒸餾法，異戊烷、異戊烯催化脫氫法，以及化學(xué)合成法。異戊二烯的化學(xué)法全合成過程復(fù)雜、原料難得、成本較高，而且隨著化石燃料的消耗以及人們對環(huán)境問題的關(guān)注，利用生物法合成異戊二烯將具有不可比擬的優(yōu)勢。雖然植物可以釋放少量的異戊二烯，但通過收集植物釋放的異戊二烯操作困難，效率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求。利用微生物如大腸桿菌、釀酒酵母等進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯具有的優(yōu)點(diǎn)包括，產(chǎn)物易于收集，純化加工，微生物生長速度快、繁殖周期短、發(fā)酵成本低、易操作等，而且與植物相比這些微生物的遺傳背景更加清晰，更易于進(jìn)行遺傳改造。

異戊二烯的生物合成方法主要依靠自然界中萜類代謝途徑的酶系，即甲羥戊酸途徑（MVA?pathway）和非甲羥戊酸途徑（MEP?pathway），異戊二烯經(jīng)萜類共同合成途徑的中間產(chǎn)物二甲基丙烯基焦磷酸及異戊二烯焦磷酸，通過異戊二烯合成酶催化形成，因此，增加異戊二烯前體物質(zhì)二甲基丙烯基焦磷酸的積累量是提高異戊二烯產(chǎn)量的重要條件之一。另外，目前在微生物中還未發(fā)現(xiàn)異戊二烯合成酶，因此，異源表達(dá)植物來源的異戊二烯合成酶是實(shí)現(xiàn)微生物合成異戊二烯的必要條件。在工程大腸桿菌中利用MVA途徑進(jìn)行異戊二烯的生產(chǎn)已經(jīng)取得一定的研究結(jié)果，相關(guān)研究表明MEP途徑較于MVA途徑具有更高的理論產(chǎn)率，而且通過模擬自然界中存在的多酶復(fù)合體拉近途徑中的酶分子可以有效的增強(qiáng)底物隧道效應(yīng)，縮短底物在酶分子之間的傳輸距離及時間，減少中間代謝產(chǎn)物擴(kuò)散到主體相的損失，因此實(shí)現(xiàn)利用MEP途徑生產(chǎn)異戊二烯將有助于生物法合成異戊二烯進(jìn)一步的研究，利用蛋白支架將異戊二烯合成過程中的酶分子共區(qū)域化可以為異戊二烯的微生物法高效合成提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決化學(xué)法合成異戊二烯存在的問題，以及目前生物法合成異戊二烯過程中存在的不足等（如通過簡單提高關(guān)鍵酶的表達(dá)量和酶活而造成代謝流不平衡），提供一種提高異戊二烯產(chǎn)量的新方法，該方法是利用蛋白支架將MEP途徑中的三種酶分子共區(qū)域化，通過縮短底物在酶分子之間的傳輸距離及時間增強(qiáng)底物隧道效應(yīng)，從而提高異戊二烯前體物質(zhì)DMAPP及IPP的積累量，再表達(dá)植物來源的經(jīng)密碼子優(yōu)化的異戊二烯合成酶實(shí)現(xiàn)異戊二烯的合成。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種提高異戊二烯合成量的大腸桿菌工程菌株構(gòu)建方法，從枯草芽孢桿菌SL-14（Bacillus?subtilis）中克隆脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS，脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因DXR，從大腸桿菌C600（Escherichia?coli）中克隆2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶基因IspD，將三個靶酶基因分別與支架蛋白的配體通過一段甘氨酸與絲氨酸組成的九肽連接，將獲得的基因片段通過Gibson組裝的方法與pET28a質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-scaffold。將銀白楊（Populus?alba）的異戊二烯合成酶基因IspS密碼子優(yōu)化并合成，與支架蛋白以及pET21b質(zhì)粒進(jìn)行Gibson組裝，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET21b-GSP-IspS，將兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得工程菌株BL21(DE3)-ScaS。

本發(fā)明的大腸桿菌工程菌株BL21(DE3)-ScaS，其中強(qiáng)化表達(dá)了脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶DXS，脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR，2-甲基赤蘚糖醇-4-焦磷酸合成酶IspD，導(dǎo)入了外源的蛋白支架和異戊二烯合成酶IspS，其中DXS、DXR及IspD在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)后可在蛋白支架的作用下共區(qū)域化而發(fā)揮作用。

本發(fā)明通過蛋白支架方法獲得的大腸桿菌工程菌株能夠發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯并提高其產(chǎn)量，具有以下優(yōu)點(diǎn)：