[發明專利]一種豬腸道組織中白細胞介素17熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201410084252.7
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN103865926B
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 董曉麗;蘇華荔;王安如;閆軼潔
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;江西大北農科技有限責任公司;哈爾濱大北農牧業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種豬腸道組織中白細胞介素17熒光定量PCR檢測方法。該方法包括設計特異性熒光定量PCR引物，建立熒光定量PCR反應體系和反應程序，制備含有目的片段IL?17的質粒作為標準質粒繪制標準曲線，最后待測樣品的目的基因和內參基因GAPDH同時擴增，根據相對定量△△C_T方法檢測基因的表達量。本發明由于利用了熒光定量PCR具有靈敏度高，特異性強，無污染且實時、準確、快速的特點，為檢測豬腸道部位的IL?17表達水平，從而輔助評價動物腸道部位免疫狀態或疾病過程提供了一個實用方法。

技術領域

本發明涉及一種豬腸道組織中白細胞介素17熒光定量PCR檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

白細胞介素17（IL-17）是一種重要的促炎癥細胞因子，由輔助性T細胞（Th17）及先天性免疫細胞等分泌，在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用。

在動物體內微環境作用下，幼稚型T細胞可分化為Th1，Th2，Th17，Th22，濾泡輔助性T細胞和Treg細胞亞型。其中Th17細胞是一種能夠分泌IL17細胞因子的獨特亞型。IL-17是一種由Th17細胞，自然殺傷性T細胞，γσT細胞等表達的促炎性細胞因子，在自身免疫性疾病及多種炎性反應中發揮關鍵作用。人類IL-17相關研究表明，該因子是聯系天性免疫反應與獲得性免疫反應重要橋梁，并對二者均有有效地促進作用。豬的IL-17因子于2004年由Katoh等人克隆并描述后，也成為豬免疫學研究檢測的重要指標之一。豬的消化道是營養學與病理學研究的重要組織部位，對豬腸道部位IL-17進行精確定量可有助于我們對被檢豬只免疫狀態及其疾病過程分析提供有力的理論數據支持。

目前，檢測細胞因子的常用方法主要分為從蛋白水平和基因水平檢測兩種。蛋白水平的檢測包括：（1）流式細胞術，主要是利用熒光標記的抗細胞因子抗體標記表達該細胞因子的細胞，再通過流式細胞儀用單細胞分析的方式從蛋白水平檢測。此方法雖特異性強，但操作過程繁瑣代價較高，難于推廣。（2）Western-blot方法，即通過酶標的抗細胞因子抗體與固定到變性凝膠上的蛋白樣品進行雜交，該方法多用于定性檢測，用于定量時操作水平要求較高，精確度較低。（3）ELISA方法，該方法主要用于檢測分泌型的細胞因子，例如血清中的蛋白水平，難以反應細胞內的情況。基因水平的檢測包括普通聚合酶鏈式反應（PCR）技術與實時熒光定量PCR技術。常規PCR由于靈敏度較低也僅常用于定性檢測，而熒光定量PCR具有靈敏度高，且實時、定量、快速等特點。常用熒光定量PCR技術又分為熒光探針法（TaqMan探針技術）與熒光染料法（SYBRGreen法）。與TaqMan技術相比，SYBR Green法實驗設計簡單，無需設計多個探針即可快速檢測多個基因，初始成本更低，通用性好。然而，目前關于用染料法檢測豬腸道的白細胞介素-17的熒光定量的檢測方法卻鮮有報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種豬腸道組織中白細胞介素17轉錄本熒光定量PCR檢測方法。

首先，本發明提供一種白細胞介素17轉錄本熒光定量PCR引物，正向引物具有SEQID No.1所示的序列，反向引物具有SEQ IDNo.2所示的序列。

進一步地，本發明還提供一種豬腸道組織中白細胞介素17轉錄本熒光定量PCR檢測方法，其為將腸道樣品制備成cDNA，用所述的引物進行熒光定量PCR反應。

在本發明一個具體實施方案中，所述豬腸道組織中IL-17轉錄本熒光定量PCR檢測方法包括如下步驟：首先設計前述的特異性熒光定量引物，然后建立實時定量PCR反應體系和反應程序，制備含有目的片段的質粒作為標準質粒繪制標準曲線，最后將待測樣品的目的基因IL-17與內參基因GAPDH同時擴增，根據相對定量△△C_T方法確定目的基因的表達變化。

本發明檢測方法中，每20μl的熒光定量PCR反應體系如下：10μl熒光定量PCR預混液，5μmol/L正向引物、反向引物各0.5μl，2μl標準質粒或樣本cDNA，用水補足至20μl。