[發明專利]一種同時檢測甲型、乙型及丙型流感病毒的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201410083254.4
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN104032034A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 王全意;楊鵬;崔淑娟;張莉;彭曉旻;張代濤;吳雙勝
• 申請（專利權）人: 王全意
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術應用領域，尤其是用于甲型、乙型及丙型流感病毒的同時檢測與鑒定。

背景技術

甲、乙、丙型流感病毒是引起人類流感的主要病原體成員，屬于正粘病毒科，為單股負鏈、分節段的RNA病毒，其基因組由8個片段組成(丙型流感病毒由7個片段組成)，甲型流感病毒對多種禽類和哺乳動物也具有高度傳染性，也可引起每年季節性流行和反復的大流行，對全世界經濟和公共衛生都造成了嚴重的危害。

甲型流感病毒的8個基因組至少編碼10種蛋白，包括兩種表面糖蛋白(HA和NA)，六種內部蛋白(NP，PB1，PB2，PA，M1和M2)和兩種非結構蛋白(NS1和NS2)。根據HA和NA抗原性不同，甲型流感病毒可分為16個HA亞型(H1～H16)和9個NA亞型(N1～N9)。目前16個HA亞型均可感染禽類，而感染人的流感目前只發現H1、H2、H3、H5、H7及H9亞型。H1和H3兩種亞型在人群中一直存在，與乙型流感病毒一起構成了季節性流感的主要病原。乙型流感病毒根據其抗原性和基因特性的不同分為兩大譜系，即Yamagata系和Victoria系。丙型流感病毒在遺傳學上比甲型和乙型流感病毒較為穩定，但人群中血清抗體仍一直存在。所以，加強甲、乙、丙型流感病毒的檢測尤為重要。

目前，國內外檢測流感病毒的經典方法是病毒的分離培養，但是其操作煩瑣，耗費時間長；電鏡、免疫組化、ELISA、常規PCR等具有各自突出的優點，但都很難檢測微量核酸和準確定量，20世紀末發展起來的實時熒光定量PCR技術(Real-time?fluorescent?quantitative?PCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，該技術不僅實現了對模板的定性和定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實驗多重反應、自動化程度高、無污染性、具有實時性和準確性等特點。因而，在呼吸道病原體檢測中具有巨大應用優勢。相對普通PCR及單熒光PCR，多重熒光PCR具有以下優點：(1)檢測效率高，即多重熒光PCR可以實現一管多檢，通過收集的不同波長的熒光信號來區分不同的檢測對象，從而簡化操作流程；(2)節省試劑成本和人員操作時間，尤其在開展大量樣品檢測時，可以顯著地降低檢測成本和操作時間。(3)本方法中含內質控基因的監控，在各類標本中，存在各種影響或抑制PCR反應的因素，且在標本的采集處理、核酸提取、擴增和分析過程中，也可能因人為操作失誤而導致產生假陰性檢測結果。因此本申請采用內質控的方法，在標本中含有的內質控基因(LDHA)經歷檢測標本核酸提取、加樣、PCR擴增及信號檢測的全過程，從而可對每一份標本實施監控。

本發明成功建立的可同時檢測甲型、乙型及丙型流感病毒一步法多重熒光RT-PCR方法，采用LDHA作為內質控，可以有效監控樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結果。并且該方法除了具有特異性強、靈敏度高、檢測效率高及穩定性的特點之外，其檢測所需要RNA量較少，且操作簡便快速，在病毒的現場檢測、衛生評價、臨床診斷等方面顯示出良好的應用前景。并有利于進一步深入研究相關病原體感染的分子機理和免疫調節機理、開展有效的臨床治療等方面顯示出良好的應用前景。

發明內容

本發明是由國家“十二五”科技重大專項2012ZX10004215-003-001支持的。我們成功設計和合成了針對甲型、乙型及丙型流感病毒相應M基因、NS基因及NP基因特異性引物和探針。基于此引物和探針，我們建立了一步法含內質控的多重熒光RT-PCR檢測方法。該方法通過對多種相關病毒的檢測、標準曲線的構建、與商品化單重熒光RT-PCR診斷試劑盒比較、穩定性試驗等，說明該方法具有較高的特異性、靈敏度、穩定性和高效性。

在本發明的第一方面，提供了一種針對甲型、乙型及丙型流感病毒M基因、NS基因及NP基因的特異性引物和探針序列，如SEQ?NO：1至12所示。

在本發明的第二方面，提供一種同時檢測甲型、乙型及丙型流感病毒的試劑盒，該試劑盒中含有第一方面所述引物和探針。

在一個實施方案中，所述試劑盒包括以下成份：

a)反應緩沖液，所述緩沖液為常規PCR反應緩沖液；

b)反應酶，所述反應酶為常規PCR反應酶；

c)SEQ?NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ?NO：3、6、9、12所示的探針

e)無RNA酶的水。