[發(fā)明專利]諾氟沙星的七肽抗原模擬表位及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410082733.4
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103965290A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何慶華;許楊;熊爭平
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;C12N15/11;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及諾氟沙星抗原模擬表位及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

諾氟沙星(Norfloxacin, NOR)是一種廣譜抗生素，在空氣中能吸收水分，遇光色漸變深，在二甲基甲酰胺中略溶，在水或乙醇中極微溶解，在醋酸、鹽酸或氫氧化鈉溶液中易溶，其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對多數(shù)細菌在體外具良好抗菌作用，如腸桿菌科的大部分細菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等。諾氟沙星體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性。對青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星為殺菌劑，通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細菌死亡。然而由于抗生素的濫用，對于諾氟沙星殘留的檢測的顯得尤為重要。

目前，檢測食品中諾氟沙星的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學檢測等方法，免疫學檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優(yōu)勢在諾氟沙星的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在建立免疫學檢測方法的過程中，必須使用諾氟沙星標準品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，諾氟沙星不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學檢測方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來實現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術(shù)的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。

本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫技術(shù)，從肽庫中篩選出能與靶分子（抗諾氟沙星單克隆抗體）特異性結(jié)合的多肽（抗原模擬表位），該抗原模擬表位具有與天然諾氟沙星分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過獲得的諾氟沙星抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的諾氟沙星標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于諾氟沙星的免疫學檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以抗諾氟沙星單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，分別投入噬菌體隨機展示環(huán)七、十二肽庫，分別進行親和淘選，獲得了四種諾氟沙星的抗原模擬表位（環(huán)七肽及十二肽各1種）。它們的氨基酸序列如下：

諾氟沙星抗原模擬表位1：從噬菌體隨機環(huán)七肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），其氨基酸序列為：CKFGFEPFC。

諾氟沙星抗原模擬表位2：從噬菌體隨機環(huán)七肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：CNTARWPFC。

諾氟沙星抗原模擬表位3：從噬菌體隨機十二肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：DHAYWPKFWGKA。

諾氟沙星抗原模擬表位4：從噬菌體隨機十二肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：SRMGPENWDKWY。

本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，優(yōu)選為AAG TTT GGG TTT GAG CCG TTT； GTT AAT ACG GCG AGG TGG CCG TTT；GAT CAT GCG TAT TGG CCG AAG TTT TGG GGT AAG GCT；AGT CGG ATG GGT CCG GAG AAT TGG GAT AAG TGG TAT。

上述抗原模擬表位（多肽）結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基。模擬表位1的N末端和C末端的兩個半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)二硫鍵，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。