[發(fā)明專利]變異鏈球菌rnc基因突變株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410082324.4
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103992962B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡濤;楊英明;李克增;張茹;劉思茗;毛夢瑩;雷蕾;陽燕
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K35/744;A61P1/02;C12R1/46
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株通過變異鏈球菌UA159構(gòu)建、篩選和鑒定而獲得的長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突變株及其在預(yù)防齲病方面的應(yīng)用。該變異鏈球菌rnc基因突變株可制成微生態(tài)制劑，作為變異鏈球菌的替代菌株，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生，屬于齲病預(yù)防技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

齲病發(fā)病率高，是最常見的人類感染性疾病之一，WHO調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球約有50億人患有齲病。在我國，2005年全國第三次口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示，5歲兒童的患齲率約為66％，中年人群為88.1％，65歲以上老年人群則高達(dá)98％，但齲病的治療率則不足10％。5歲組乳牙齲齒個數(shù)3.5顆(dmft),35-44歲組恒牙齲齒個數(shù)4.51顆(DMFT),65-74歲組恒牙齲齒個數(shù)14.65顆(DMFT)。?

變異鏈球菌是與齲病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的主要致齲菌。它通過代謝口腔內(nèi)的碳水化合物產(chǎn)酸、導(dǎo)致牙菌斑生物膜的pH值下降來抑制其他共生菌的生長，從而奠定自己在生物膜中的優(yōu)勢地位。變異鏈球菌通過生物膜的形成，依靠細(xì)胞外基質(zhì)的保護(hù)和其他信號傳導(dǎo)通路來應(yīng)對環(huán)境變化帶來的壓力。其分泌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶可以有效合成細(xì)胞外多糖，一方面促進(jìn)細(xì)菌與牙齒表面的黏附，一方面為其他的細(xì)菌的定植提供結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)穩(wěn)定生物膜的形成。變異鏈球菌的主要致齲毒力因子主要包括其產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成、生物膜形成能力等。?

rnc基因是近年來在其他細(xì)菌中被廣泛研究的基因。其在大腸桿菌中編碼雙鏈RNA特異性的內(nèi)切核糖核酸酶RNase?III，參與編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子gadX-gadW的mRNA處理過程，從而控制大腸桿菌對酸的反應(yīng)。RNase?III還被認(rèn)為影響一些噬菌體、質(zhì)粒和細(xì)胞基因的表達(dá)，在RNA處理、轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)控制、防御病毒入侵方面起著非常重要的作用。在天藍(lán)色鏈霉菌中，RNase?III被認(rèn)為與孢子的形成和抗生素的產(chǎn)生有關(guān)。盡管RNaseIII在一些細(xì)菌內(nèi)的生理功能被大量研究，但是在變異鏈球菌中存在的編碼RNase?III酶的rnc基因的功能并未被研究。其是否參與變異鏈球菌的一些生物學(xué)特性的調(diào)控，是否與變異鏈球菌致齲性有關(guān)尚不清楚。?

迄今為止尚未見到有關(guān)變異鏈球菌rnc基因突變菌株的構(gòu)建及其在防治齲病中的應(yīng)用的報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

針對上述齲病高發(fā)，且沒有特效藥物防治的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一株長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突變株及其在預(yù)防齲病方面的應(yīng)用。該變異鏈球菌rnc基因突變株可制成微生態(tài)制劑，作為變異鏈球菌的替代菌株，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生。?

本發(fā)明的技術(shù)思路是：首先，基于齲病的防治尚無特效的藥物，且由于變異鏈球菌是口腔最常見的致齲菌，因此選擇致齲菌的變異鏈球菌作為內(nèi)源性生態(tài)防齲的突破口，實(shí)施基因突變技術(shù)對目的基因進(jìn)行敲除，可穩(wěn)定地產(chǎn)生一株呈長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌基因突變株；然后，采用PCR技術(shù)以及DNA測序的方法，該株鑒定為變異鏈球菌rnc基因敲除突變株；最后，對含該株細(xì)菌的培養(yǎng)液進(jìn)行人類齲病動物模型的致齲試驗(yàn)，結(jié)果顯示出該突變菌株具有能夠減少SPF級Vistar大鼠齲病的發(fā)生率的效果。?

具體講，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：?

本發(fā)明獲得具有呈長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌rnc基因突變株的方法是(見圖1)：采用從位于中國四川省成都市的口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室處獲取的變異鏈球菌UA159(以下簡稱為“S.mutans?UA159”)作為父本株(注：是采用單株進(jìn)行基因突變)，用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用PCR連接誘變技術(shù)進(jìn)行突變株的構(gòu)建，得到一株抗紅霉素、呈長鏈狀、低致齲能力，能改善大鼠口腔的菌群結(jié)構(gòu)，減少大鼠齲病的發(fā)生率的變異鏈球菌的rnc基因突變菌株，然后進(jìn)行產(chǎn)酸、耐酸、耐氧化、早期粘附、生物膜形成及胞外多糖形成能力以及細(xì)菌毒力相關(guān)因子的比較試驗(yàn)。通過PCR擴(kuò)增出突變菌株的DNA片段，經(jīng)測序，獲得目的基因序列，證實(shí)rnc基因被成功的敲除，確定該分離的菌株突變成功，該菌株為變異鏈球菌rnc基因缺失突變株(Streptococcus?mutans?HT120211)，它擁有更長的鏈狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更少的致齲毒力因子,已于2013年5月16日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2013年5月16日，保藏編號為：CCTCC?NO:M2013211。?