[發(fā)明專利]模擬諾氟沙星的抗原模擬表位及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410081896.0
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN104119425B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何慶華;許楊;熊爭平
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K7/06;C12N15/11;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及諾氟沙星抗原模擬表位及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

諾氟沙星(Norfloxacin,?NOR)是一種廣譜抗生素，在空氣中能吸收水分，遇光色漸變深，在二甲基甲酰胺中略溶，在水或乙醇中極微溶解，在醋酸、鹽酸或氫氧化鈉溶液中易溶，其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對多數(shù)細(xì)菌在體外具良好抗菌作用，如腸桿菌科的大部分細(xì)菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等。諾氟沙星體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性。對青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星為殺菌劑，通過作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。然而由于抗生素的濫用，對于諾氟沙星殘留的檢測的顯得尤為重要。

目前，檢測食品中諾氟沙星的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學(xué)檢測等方法，免疫學(xué)檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優(yōu)勢在諾氟沙星的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在建立免疫學(xué)檢測方法的過程中，必須使用諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，諾氟沙星不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來實現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術(shù)的主要特點是可有效地篩選出與目標(biāo)靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。

本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫技術(shù)，從肽庫中篩選出能與靶分子（抗諾氟沙星單克隆抗體）特異性結(jié)合的多肽（抗原模擬表位），該抗原模擬表位具有與天然諾氟沙星分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過獲得的諾氟沙星抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應(yīng)用于諾氟沙星的免疫學(xué)檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以抗諾氟沙星單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標(biāo)板上，分別投入噬菌體隨機展示環(huán)七、十二肽庫，分別進行親和淘選，獲得了四種諾氟沙星的抗原模擬表位（環(huán)七肽及十二肽各1種）。它們的氨基酸序列如下：

諾氟沙星抗原模擬表位1：從噬菌體隨機環(huán)七肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），其氨基酸序列為：CKFGFEPFC。

諾氟沙星抗原模擬表位2：從噬菌體隨機環(huán)七肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：CNTARWPFC。

諾氟沙星抗原模擬表位3：從噬菌體隨機十二肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：DHAYWPKFWGKA。

諾氟沙星抗原模擬表位4：從噬菌體隨機十二肽庫中篩選的諾氟沙星抗原模擬表位（多肽），

其氨基酸序列為：SRMGPENWDKWY。

本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，優(yōu)選為AAG?TTT?GGG?TTT?GAG?CCG?TTT；?GTT?AAT?ACG?GCG?AGG?TGG?CCG?TTT；GAT?CAT?GCG?TAT?TGG?CCG?AAG?TTT?TGG?GGT?AAG?GCT；AGT?CGG?ATG?GGT?CCG?GAG?AAT?TGG?GAT?AAG?TGG?TAT。

上述抗原模擬表位（多肽）結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基。模擬表位1的N末端和C末端的兩個半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)二硫鍵，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。