[發明專利]提高機體糖原儲備的牦牛皮大分子膠原蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410080302.4
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103805669A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 杜玉枝;魏立新;楊紅霞;畢宏濤;庫進良
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所;青海信成醫藥集團有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/14
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

技術領域

本發明涉及一種膠原蛋白的制備方法，尤其涉及提高機體糖原儲備的牦牛皮大分子膠原蛋白的制備方法。

背景技術

糖原是由多個葡萄糖組成的大分子多糖，是體內糖的貯存形式，主要貯存在肌肉和肝臟中，在肌肉中約占1~2%，肝臟中約占6~8%。

肌糖原酵解后可提供組織能量，能夠滿足活動時肌肉對能量需要，特點是釋放能量時不需要氧參與，在高海拔缺氧條件下或無氧條件下均可以及時提供機體需要的能量，肌糖原儲備與缺氧、疲勞密切相關。肝糖原是葡萄糖聚合物以糖原的形式儲存于肝臟，當機體需要時，可分解成葡萄糖，轉化為能量。肝糖原和肌糖原都可以調理血糖，不同的是肝糖原分解直接變成葡萄糖，維持血糖均衡，而肌糖原需由肝臟轉換成肝糖原后在分解變成葡萄糖。

牦牛是中國古老而又原始的牛種之一，是唯一能在青藏高原生態環境下生存繁衍的牛種，是青藏高原特有的優勢畜種，具有獨特的生態學特性及經濟價值。經過千百年的自然選擇與進化，形成了其獨特的遺傳性能和對高寒缺氧惡劣環境的適應能力，具有極強的抗逆能力、抗病能力、耐受性和適應性，能適應一般家畜不能適應的高海拔、高缺氧等嚴酷的高寒惡劣生態環境。牦牛體內含有許多抗疲勞、抗缺氧的生物活性物質，從牦牛皮中提取純天然的膠原蛋白，提供人體能量儲備很有必要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種方法簡單、效果顯著的提高機體糖原儲備的牦牛皮大分子膠原蛋白的制備方法。

為解決上述問題，本發明所述的提高機體糖原儲備的牦牛皮大分子膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

⑴將新鮮或經浸潤、軟化后的干燥的青藏高原特有牛種牦牛wild?yak?的牦牛皮清洗干凈，放入pH值為4~9的水溶液中，然后加入質量濃度為0.1~20%的酶，在溫度為10~50℃的條件下酶解2~20小時，得到保毛脫毛后的牦牛皮；

⑵將所述保毛脫毛后的牦牛皮按其重量的2~5倍加入水，并在溫度為30~80℃的條件下加熱1~30分鐘后，用清水沖洗2~3次，洗凈殘余毛屑，得到滅酶后的牦牛皮；

⑶將所述滅酶后的牦牛皮剪切成3~5cm的小塊，然后加入其重量5~20倍的水進行提取，提取時間為2~10小時后，過濾，棄去殘渣，得到濾液；

⑷將所述濾液濃縮至比重為1：1.2~1.5時，加入溫度為0~10℃涼水，提沫，并重復3~8次，得到除沫后的濾液；

⑸將所述除沫后的濾液用其體積的5~50倍水稀釋后，在分離溫度為30~50℃的條件下進行分離，即得14~25Kda大分子的牦牛皮膠原蛋白溶液；

⑹將所述14~25Kda大分子的牦牛皮膠原蛋白溶液經濃縮、干燥，即得牦牛皮大分子膠原蛋白。

所述步驟⑴中酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或兩種。

所述步驟⑸中的濾液分離為離心、膜分離、透析方法中的任意一種。

所述步驟⑹中的濃縮是指減壓濃縮、吹干濃縮方法中任意一種。

所述步驟⑹中的干燥條件為噴霧干燥、冷凍干燥、微波干燥、烘箱干燥中的任意一種。

本發明與現有技術相比具有以下優點：

1、本發明以牦牛皮為原料，通過酶法保毛脫毛處理牦牛皮，經過提取分離得到大分子膠原蛋白。采用該方法制得的牦牛皮膠原蛋白分子量分布集中，其分子量在14~25?KDa?，粒徑大小在5.8~8?nm?之間，含量大于98%以上（參見表1、表2、圖1、圖2）。

表1???牦牛皮膠原DLS動態光散射測定結果

注：Item為對同一批樣品進行測定次數。

表2??牦牛皮膠原不同粒徑峰值分布

2、對本發明所得的牦牛皮大分子膠原蛋白進行藥效學實驗：

⑴動物負重游泳實驗結果：

選兩個給藥劑量（200?mg/kg/d、1.0?g/kg/d）組進行，將健康KM小鼠30只隨機分成3組，雌雄各半，空白組按0.2?ml/10?g灌胃純凈水，連續給藥七天。給藥前后小鼠的體重、力竭游泳時間進行了比較分析，觀察不同給藥劑量小鼠力竭游泳時間及體重的影響（參見表3）。

表3不同給藥劑量對小鼠負重游泳實驗的影響

與空白組比較：*P<0.05；**P<0.01。

⑵生化指標測定：

將健康KM小鼠30只，隨機分成3組，雌雄各半，兩個給藥組（低、高）、空白對照組，給藥七天。檢測總蛋白（TP）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸（LA）、肝糖元、肌糖元的含量（參見表4）。