[發明專利]一對靶向綿羊DKK2基因的sgRNA

有效

• 申請號: 201410069919.6
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103805605B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 趙金山;李和剛;柳楠;程明;劉開東;劉積鳳
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;青島市畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C40B40/08
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技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體而言，涉及一對靶向識別綿羊DKK2基因的sgRNA及其應用。

背景技術

ZFN和TALEN打靶技術是目前研究較為成熟的兩種定點突變技術，但是這兩種技術構建程序較為繁瑣，每一個位點需要構建一對相應的核酸酶。而CRISPR/Cas9系統對特異位點的識別靠小的crRNA的引導，CRISPR區可以有一系列的crRNA組成，每個針對特異位點的crRNA只有幾十個堿基，整個載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構建(CRISPR/Cas9新型基因打靶系統的研究進展.江蘇農業學報.李輝等，2013)。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防御機制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等(Multiplex?Genome?Engineering?Using?CRISPR/Cas?Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided?human?genome?engineering?via?Cas9.Science.2013)證明Cas9系統能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重組(NHEJ)、同源重組(HR)效率在3-25％之間，與TALEN酶切效果相當。他們還證明，多個靶點可以同時進行靶向酶切。但是，隨后的研究表明，Cas9存在較為明顯的脫靶效應(High-frequency?off-target?mutagenesis?induced?by?CRISPR-Cas?nucleases?in?human?cells.Nature?Biotechnology.Fu?et?al，2013；High-throughput?profiling?of?off-target?DNA?cleavage?reveals?RNA-programmed?Cas9nuclease?specificity.Nature?Biotechnology.Pattanayak?et?al，2013)。麻省理工學院Feng?Zhang團隊使用雙切刻技術將Cas9的特異性提高了50倍以上(Double?nicking?by?RNA-guided?CRISPR?Cas9for?enhanced?genome?editing?specificity.Cell.Ran?et?al，2013)，維護了Cas9在基因打靶技術領域的地位。借助于這一技術，動植物基因功能研究及育種等等都將得到迅猛的發展。

DKK基因家族是WNT信號通路的抑制因子，而WNT信號轉導調控毛囊的生長發育。DKK2是DKK基因家族的重要成員。DKK2的高度過表達導致小鼠幾乎無毛；DKK2相對較低水平的過表達，小鼠被毛出現，但是結構異常(Wnt?and?dkk?determine?hair?follicle?spacing?through?a?reaction-diffusion?mechanism.Science.Sick?et?al，2006)。Foxnl：：Dkk2中度過表達小鼠，單位面積的毛囊數量下降了30％，毛囊呈束狀排布。Sick等使用反應-擴散模型還預測，DKK的表達量下降或降解加速會導致毛囊間距降低(Wnt?and?dkk?determine?hair?follicle?spacing?through?a?reaction-diffusion?mechanism.Science.Sick?et?al，2006)。與這一預測相一致的是，抑制BMP信號導致毛囊密度增加(Makin?gwaves?with?hairs.J?Invest?Dermatol.Plikus?et?al，2004)，而抑制BMP可能降低DKK2表達(The?Wnt?antagonist?Dickkopf-1is?regulated?by?Bmp?signaling?and?c-Jun?and?modulates?programmed?cell?death.EMBO?J.Grotewold?et?al，2002)。

由此可見，DKK2是細毛羊育種的重要候選基因。在細胞或個體水平上對綿羊DKK2基因進行敲除或修飾，可解析綿羊DKK2基因的功能，為細毛羊的羊毛細度育種服務。

發明內容