[發(fā)明專利]一種小鼠腸道菌群失調(diào)ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410055356.5
• 申請日: 2014-02-19
• 公開（公告）號: CN103773887A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 倫永志;孫麗妲
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大連智慧專利事務(wù)所 21215
• 代理人: 周志艦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細菌基因組指紋圖譜制備領(lǐng)域，特別涉及一種小鼠腸道菌群失調(diào)ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。

背景技術(shù)

菌群失調(diào)（dysbacteriosis）是基礎(chǔ)及臨床研究經(jīng)常遇到的問題，它是外源性感染和內(nèi)源性感染的起始因素，一旦發(fā)生很難控制。引起菌群失調(diào)的因素有很多，包括飲食因素、菌叢的變化因素、藥物的代謝因素、年齡因素及胃腸道免疫功能障礙因素。因此，對于機體腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性及種群動態(tài)變化進行研究對治療菌群失調(diào)具有至關(guān)重要的意義。

最常見的、也是最被人們所熟悉的一種菌群失調(diào)，就是“腹瀉”癥狀。腹瀉是一種糞便稀薄、排便次數(shù)增加的表現(xiàn)，為多種類似癥狀的統(tǒng)稱。在臨床上一般將其分為感染性腹瀉和非感染腹瀉2種，其中感染性腹瀉約占80%。對于感染性腹瀉，人們習(xí)慣于使用抗生素進行治療，然后由于抗生素的大量盲目使用，使腸道中有益菌被抑制，使其數(shù)量急劇減少，腸道微生態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致菌群失調(diào)，此時腸上皮細胞的代謝調(diào)節(jié)水平和生理功能發(fā)生紊亂，使腹瀉進一步加重，即抗生素相關(guān)性腹瀉（Antibiotic?Associated?Diarrhea，AAD）。其發(fā)生率視不同抗生素而異，約為15％～39％。凡能對抗細菌的藥物，幾乎均可引起AAD，多見于氯林可霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、阿奇霉素、頭孢菌素等抗生素。為深入開展菌群失調(diào)研究，常需要建立抗生素相關(guān)性腹瀉動物模型。

檢測菌群失調(diào)一般采用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法，雖然可行，但腸道內(nèi)微生物多數(shù)都是厭氧菌，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法難以分析，并且傳統(tǒng)的細菌分離和培養(yǎng)方法操作繁瑣，耗時、費力，重復(fù)性差，易受操作方法等因素的影響。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些基于微生物遺傳物質(zhì)的分子生物學(xué)方法，如PFGE、RAPD-PCR、REA、RFLP、ERIC-PCR等，可以克服傳統(tǒng)方法的缺陷，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比優(yōu)勢明顯，已應(yīng)用于微生物群落分析研究中。其中，以腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（enterobacterial?repetitive?intergenic?consensus?sequences，ERIC）為基礎(chǔ)的ERIC-PCR指紋圖譜鑒定，具有靈敏度高、可重復(fù)性和可靠性好、省時省力，是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。ERIC是存在于多種細菌基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列，主要存在于腸道細菌基因組間，目前尚未在細菌噬菌體和質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)有ERIC的存在。ERIC具有不完整的反向重復(fù)性和高度保守性，二級結(jié)構(gòu)可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該序列長約44bp，在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)隨物種的不同而有差異。由于不同的細菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，可根據(jù)這一ERIC核心序列設(shè)計反向引物進行PCR擴增，得到一系列有大小不同的片段組成的DNA指紋圖譜，即DNA遷移帶。在一定范圍內(nèi)，DNA遷移帶的大小和多少代表著此重復(fù)序列間的距離和重復(fù)次數(shù)。因此，基因組DNA的差異可清晰顯示在指紋圖譜上，根據(jù)電泳條帶來區(qū)分菌株（型）。ERIC-PCR指紋圖譜具有高度的穩(wěn)定性和良好的可重復(fù)性。

采用ERIC-PCR方法對正常小鼠和抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠進行腸道菌群基因組DNA擴增，快速檢測并獲得菌群分布狀況。與傳統(tǒng)方法比較，可以得出較為準確的菌群定性結(jié)果。這對于相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究，尤其是流行性腸道疾病快速診斷會有很大的用途。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以小鼠為研究對象，解決傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法應(yīng)用于微生物群落分析所帶來的不足，而建立的一種小鼠腸道菌群失調(diào)的ERIC-PCR指紋圖譜的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體步驟為：建立抗生素相關(guān)性腹瀉致小鼠腸道菌群失調(diào)動物模型、提取盲腸內(nèi)容物DNA、清除盲腸內(nèi)容物DNA腐殖酸、清除盲腸內(nèi)容物DNA中的PCR抑制物、ERIC-PCR擴增、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）。

本發(fā)明的制備方法如下：

（1）采用糞便DNAout試劑盒，從盲腸內(nèi)容物標(biāo)本中提取基因組DNA，方法如下：

a、65℃預(yù)熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，然后取0.5mL加入到1.5mL塑料離心管中并放置于65℃待用。最好使用螺旋蓋離心管；

b、取0.1-0.3g的新鮮或冷凍的盲腸內(nèi)容物，加入到含預(yù)熱溶液A的離心管中，振蕩器上劇烈振蕩使菌體樣品裂解，再加B液處理并抽提、乙醇沉淀和洗滌，所得DNA沉淀溶解于TE或無菌水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）所提取的盲腸內(nèi)容物DNA用柱式腐殖酸清除劑清除腐殖酸得到純化的DNA溶液，去除DNA溶液中小鼠腸道細菌蛋白質(zhì)、腐殖酸。