[發(fā)明專利]高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410054696.6
• 申請(qǐng)日: 2014-02-18
• 公開（公告）號(hào): CN103756984A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏景艷;郭笑;宋健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/08
• 分類號(hào): C12N9/08;C12N15/70;C12N15/85
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 張景林;王恩遠(yuǎn)

1.一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No:1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其特征在于：將SEQ?ID?No:1所示的氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的丙氨酸Ala突變?yōu)榻z氨酸Ser所形成的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體。

3.如權(quán)利要求2所述的一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其特征在于：所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No:2所示。

4.如權(quán)利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其特征在于：SEQ?ID?No:1所示的氨基酸序列中第55、68、77、105位4個(gè)絲氨酸的任何一個(gè)或多個(gè)被丙氨酸取代后所形成的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體。

5.如權(quán)利要求4所述的一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其特征在于：所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No:3所示。

6.一種高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5或SEQ?ID?No:6所示。

7.權(quán)利要求1所述的高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX2突變體的制備方法，其步驟如下：

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)本發(fā)明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因；或其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX2突變體蛋白，且全長(zhǎng)不含有ACA序列的編碼基因；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX2突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而GPX2突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化：

用步驟1）中構(gòu)建的含有GPX2突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將含有表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的pMazF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低溫4-25℃誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

所述的將液體低溫離心，是在4℃，8000-12000g離心15-30min；

或，

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)基因文庫(kù)中公開的GPX2的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX2中要突變?yōu)榘腚装彼岬?0位硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX2基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點(diǎn)突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子，再根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX2基因中所有ACA序列突變掉；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及突變體蛋白的表達(dá)與純化

用步驟1）中構(gòu)建的含有GPX2突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含半胱氨酸的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷低溫4-25℃誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達(dá)出在底物谷胱甘肽的結(jié)合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX2突變體的上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

所述的將液體低溫離心，是在4℃，8000-12000g離心15-30min；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)本發(fā)明所述GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX2突變體蛋白的基因，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因；或是其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX2突變體蛋白的編碼基因；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX2突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有而GPX2突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化：

用步驟1）中構(gòu)建的含有GPX2突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

所述的將液體低溫離心，是在4℃，8000-12000g離心15-30min；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)基因文庫(kù)中公開的GPX2的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX2中要突變?yōu)榘腚装彼酑ys的40位SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp；用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX2基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子；同理，用上述定點(diǎn)突變的方法將GPX2基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX2突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化：

用步驟1）中構(gòu)建的含有GPX2突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX2突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得GPX2突變體蛋白純品；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

所述的將液體低溫離心，是在4℃，8000-12000g離心15-30min；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)本發(fā)明所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3′端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，或是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因，但靶基因的3′端必須含有GPX2基因的3′端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX2突變體基因和哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2突變體基因連同其3′端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選：

用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；

3）、靶蛋白的表達(dá)與純化：

在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細(xì)胞表達(dá)GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

所述的檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量，是以用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)本發(fā)明所述的GPX2突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX2突變體的編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3′端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列是將GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，或是其它任何一種編碼GPX2突變體蛋白的基因或硒代半胱氨酸插入序列SECIS；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX2突變體基因和哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2突變體基因連同其3′端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選：

先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株；再用含有GPX2突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株；檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；

3）、靶蛋白的表達(dá)與純化：

在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細(xì)胞表達(dá)GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

所述的檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；

所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)基因文庫(kù)中GPX2基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX2的編碼基因及其3′端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3′端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3′端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2基因連同其3′端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX2中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明所述的GPX2突變體蛋白；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選：

用含有SBP2和GPX2突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；

3）、靶蛋白的表達(dá)與純化：

在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細(xì)胞表達(dá)GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

所述的檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；

所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX2突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白；

或

1）、表達(dá)載體的構(gòu)建：

根據(jù)基因文庫(kù)中GPX2基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX2的編碼基因及其3′端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3′端在終止密碼子下游引入GPX2基因的3′端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX2基因連同其3′端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX2中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能夠編碼本發(fā)明所述的GPX2突變體蛋白；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選：

先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株；再用含有GPX2突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX2突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株；檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；

3）、靶蛋白的表達(dá)與純化：

在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細(xì)胞表達(dá)GPX2突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

所述的檢測(cè)GPX2突變體蛋白的表達(dá)量，是用抗GPX2的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；

所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX2突變體，是用pH7.5，50mmol/L?Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L?GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。