[發(fā)明專利]利用QCM傳感器檢測(cè)CP4-EPSPs蛋白的方法及專用金片

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410049536.2
• 申請(qǐng)日: 2014-02-13
• 公開（公告）號(hào): CN103792370A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃新;蔡淼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用QCM傳感器檢測(cè)CP4-EPSPs蛋白的方法及專用金片。

背景技術(shù)

草甘膦不僅是一種對(duì)于一年生和多年生雜草五中普遍適用的廣譜、高效除草劑,而且具有土壤強(qiáng)吸收性和哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類低毒性等有利于環(huán)境的特性。廣泛用于果園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理,以及出苗后定向處理,是全世界除草劑使用量最大的品種之一。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)催化倒數(shù)第二個(gè)莽草酸途徑,當(dāng)?shù)孜锪姿嵯┐急猁}有高度親和性的時(shí)候酶表現(xiàn)出高度耐草甘膦特性，在催化合成芳香酸，苯基丙氨酸和酪氨酸時(shí)這是關(guān)鍵步驟，也伴隨一些吲哚乙酸、木質(zhì)素和植物抗毒素等次生化合物。是許多抗生素除草劑的首選靶標(biāo)酶。草甘膦能與植物的EPSPs結(jié)合導(dǎo)致植物死亡。從天然的農(nóng)桿菌菌系CP4中分離的EPSPs酶有很好的抗草甘膦功能，稱CP4-EPSPs。

全球抗草甘膦作物種植面積呈逐年上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場(chǎng)以來，引起食品安全與控制的普遍警惕。草甘膦的長(zhǎng)期使用會(huì)影響土壤微生物，加大大豆根部病害幾率，而最為嚴(yán)重的是抗草甘膦雜草的出現(xiàn)，因此，掌握科學(xué)快速檢測(cè)抗性雜草的方法以便及對(duì)沒有加施標(biāo)簽予以聲明的情況下大量進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)就顯得十分迫切且意義重大。目前檢測(cè)EPSPs基因方法主要有基于核酸水平的PCR法和基于蛋白水平的酶聯(lián)免疫法和免疫層析試紙條法。闞貴珍等研究結(jié)果表明試紙條法中陰性樣品一條帶陽性樣品兩條帶，PCR檢測(cè)結(jié)果中陽性基因特異片段為146bp。董峰雙夾心酶聯(lián)免疫法結(jié)果表明檢出限為80ppb。G.J.Rogan用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆中CP4-EPSPs蛋白的檢出限為210μg/g，變異系數(shù)小于15%。

石英晶體微天平是一種簡(jiǎn)單，效價(jià)高，高分辨率，利用壓電效應(yīng)原理的質(zhì)量傳感技術(shù)。免疫學(xué)檢測(cè)法可以檢測(cè)具有抗原性的蛋白質(zhì)類表達(dá)產(chǎn)物,它是通過抗原-抗體特異性反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，抗原-抗體反應(yīng)是一種非共價(jià)鍵特異性吸附反應(yīng),在一般情況下,抗原只和由自己誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或具有相同抗原決定簇的抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)。所以,免疫學(xué)反應(yīng)具有高度的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種制備用于檢測(cè)CP4-EPSPS的QCM金片的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1）用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片；

2）將抗CP4-EPSPS抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測(cè)所述CP4-EPSPS的QCM金片。

上述方法中，上述QCM金片為單側(cè)鍍金片，12mm×20mm，單側(cè)鍍金50nm，BioNavis公司，貨號(hào)QSX301-Au-13052。

步驟1）中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備：將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中。

步驟1）中，所述浸泡為4℃浸泡12h；

上述方法中，

步驟1）中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾比為1:10。

上述方法中，

所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9M；

所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9M。

上述方法中，

步驟2）中，將抗目的蛋白抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗目的蛋白抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過共價(jià)鍵連接。

步驟2）中，所述將抗CP4-EPSPS抗體固定到所述修飾后金片具體按照如下方法制備：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修飾后金片表面，常溫（25℃）下靜置2小時(shí)；再滴加所述抗CP4-EPSPS抗體，37℃反應(yīng)3小時(shí)；再滴加濃度為1mg/mLBSA，25℃下靜置1小時(shí)，得到用于檢測(cè)所述CP4-EPSPS的QCM金片；

含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亞胺）和Sulfo-NHS（N-羥基硫代琥珀酰亞胺）的溶液：EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，使EDC在溶液中的終濃度0.075M，NHS在溶液中的終濃度為0.015M。