[發明專利]血清sH2a含量的時間分辨免疫熒光分析法及檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201410042011.6
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN104808001A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 王弢;秦勇;周小進;陳菲
• 申請（專利權）人: 蘇州工業園區為真生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 張琴

技術領域

本發明屬于蛋白檢測技術領域，涉及一種蛋白定量檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

sH2a是一種在肝臟特異性表達的可溶性分泌型蛋白，分子量約35KD。它與另一種也只在肝細胞表達的去唾液酸受體蛋白(ASGPR)的H2亞基同源，但研究表明，sH2a并不參與ASGRP?H2亞基的組裝。sH2a的前體蛋白在肝細胞表達出來后，在內質網被剪切去除約5個氨基酸變成sH2a，即被釋放到細胞外，進入血液循環。正常人外周血中sH2a保持較高水平，但在肝損傷、肝炎、肝纖維化等肝病患者中sH2a的含量顯著下降，因此，通過檢測患者血中sH2a含量可獲得肝臟功能狀況的信息，便于臨床肝損傷、肝炎、肝纖維化等肝病的輔助診斷。

發明人在前期研究工作中發明了一種sH2a定量檢測試劑盒（CN103336125A），系采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法來定量檢測sH2a，但該發明仍然存在線性范圍較窄，檢測本底較高，檢測耗時較長等問題，還有待進一步改進。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種血清sH2a含量的時間分辨免疫熒光分析法及其檢測試劑盒，具有線性范圍寬、零本底、穩定性好、靈敏度高、特異性強、準確度高、檢測時間短等優點。

經研究，本發明提供如下技術方案：

1.血清sH2a含量的時間分辨免疫熒光分析法，包括以下步驟：

A．固相抗體的制備

將抗sH2a單克隆抗體稀釋后作為包被液包被固相材料，洗滌去除包被液，再用含有封閉蛋白的緩沖液作為封閉液封閉固相材料，洗滌去除封閉液，干燥，制得包被抗sH2a單克隆抗體的固相材料；

B．標記抗體的制備

選擇能夠與步驟A中所述抗sH2a單克隆抗體配對的抗sH2a單克隆抗體，進行鑭系元素離子標記，制得標記抗體；

C．檢測

在步驟A制得的包被抗sH2a單克隆抗體的固相材料中，加入sH2a標準品或待測血清樣品，孵育，洗滌固相材料，再加入步驟B制得的標記抗體，孵育，洗滌固相材料，再加入解離增強液，震蕩，測定熒光強度，根據sH2a標準品測定結果繪制標準曲線，根據標準曲線計算待測血清樣品中的sH2a含量。

進一步，所述血清sH2a含量的時間分辨免疫熒光分析法包括以下步驟：

A．固相抗體的制備

將抗sH2a單克隆抗體用濃度為50mM、pH為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后作為包被液包被微孔反應板，洗滌去除包被液，再用含有牛血清白蛋白的PBST作為封閉液封閉微孔反應板，洗滌去除封閉液，干燥，制得包被抗sH2a單克隆抗體的微孔反應板；

B．標記抗體的制備

選擇能夠與步驟A中所述抗sH2a單克隆抗體配對的抗sH2a單克隆抗體，進行三價銪離子標記，制得標記抗體；

C．檢測

將sH2a標準品用PBS稀釋至不同濃度，作為梯度sH2a標準溶液；將步驟B制得的標記抗體用反應緩沖液稀釋，制得標記抗體工作液；在步驟A制得的包被抗sH2a單克隆抗體的微孔反應板中，加入上述梯度sH2a標準溶液或待測血清樣品，孵育，洗滌微孔反應板，再加入標記抗體工作液，孵育，洗滌微孔反應板，再加入解離增強液，震蕩，用時間分辨免疫熒光分析儀于激發波長340nm、發射波長614nm測定熒光強度，根據梯度sH2a標準溶液測定結果繪制標準曲線，根據標準曲線計算待測血清樣品中的sH2a含量。

更進一步，所述血清sH2a含量的時間分辨免疫熒光分析法包括以下步驟：

A．固相抗體的制備

將抗sH2a單克隆抗體用濃度為0.05mol/L、pH為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至5μg/ml作為包被液，以100μl/孔包被微孔反應板，4℃包被過夜，洗滌去除包被液，再用含有質量百分含量為1%的牛血清白蛋白的PBST作為封閉液，以100μl/孔封閉微孔反應板，37℃封閉2小時，洗滌去除封閉液，37℃干燥，制得包被抗sH2a單克隆抗體的微孔反應板；

B．標記抗體的制備

選擇能夠與步驟A中所述抗sH2a單克隆抗體配對的抗sH2a單克隆抗體，進行三價銪離子標記，制得標記抗體；

C．檢測