[發明專利]一種水產品中腐敗希瓦氏菌的分離和檢測方法

有效

• 申請號: 201410041477.4
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103820544A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 朱軍莉;馮立芳;趙二科
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 林君勇

1.一種檢測腐敗希瓦氏菌的引物對，其特征在于其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物組成：

第一引物對為

一條引物的序列為F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，記為SEQ?ID?NO.1，另一條的序列為?R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA?，記為SEQ?ID?NO.2；

或者是第二引物對為

一條引物的序列為F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，記為SEQ?ID?NO.3，另一條的序列為R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA???????，記為SEQ?ID?NO.4。

2.一種水產品中腐敗希瓦氏菌的分離和檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

a、腐敗希瓦氏菌的分離：無菌取鮮活水產樣品10g，加入無菌蛋白胨生理鹽水制成溶液，稀釋后涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）上進行培養，挑取菌落，分別劃線到鐵瓊脂平板上繼續培養，挑取黑色的菌落，收集細菌，抽提細菌DNA；

b、PCR分離鑒定：提取待測的產硫化氫細菌的基因組DNA，進行PCR擴增，設計的引物序列為：

F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，記為SEQ?ID?NO.1，和

R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA????，記為SEQ?ID?NO.2；

或者是

F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，記為SEQ?ID?NO.3，和

R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA???，記為SEQ?ID?NO.4。

3.根據權利要求2所述的分離和檢測方法，其特征在于：大豆酪蛋白瓊脂培養基和鐵瓊脂平板培養的溫度為25℃，培養時間為48h。

4.根據權利要求2所述的分離和檢測方法，其特征在于：擴增反應體系組分為：PCR?Buffer（含Mg²⁺）5μl，2.5?mmol/L?dNTP?4μl，20?μmol/L正反引物各l?μl，DNA模板1μl，5?U/μl?Taq酶?0.5μl，滅菌雙蒸水補足至50?μl。

5.根據權利要求2或4所述的分離和檢測方法，其特征在于：擴增反應條件：?94℃預變性5?min，變性94℃?40?s，退火55℃?1?min，延伸72℃?1?min，30個循環，終延伸72℃?5?min。

6.根據權利要求2所述的分離和檢測方法，其特征在于：所述的鐵瓊脂平板培養基的組分如下：細菌蛋白胨20?g，牛肉膏3?g，酵母浸出粉3?g，檸檬酸鐵0.3?g，硫代硫酸鈉0.3?g，NaCl?5?g，L-半胱氨酸0.6?g，瓊脂20?g，溶于1?L水中。