[發明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201410041149.4
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103740850A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 唐晶;劉文娟;張忠英
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述hsa-miR-9為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.15＇-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3＇；

所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，設有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設在盒體內，外源性參照瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶內裝有外源性參照，莖環逆轉錄試劑瓶內裝有莖環逆轉錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內裝有實時熒光定量PCR試劑。

2.如權利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述外源性參照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.25＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇；其工作濃度為5nmol。

3.如權利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述莖環逆轉錄試劑包括以下組份：200單位/μL的MMLV酶、10m?mol?dNTP混合液、5×RT緩沖液、40單位/μL的RNA酶抑制劑、10m?mol的MgCl₂、1μmol的特異的miRNA的逆轉錄引物、miRNA標準品，濃度為100n?mol；所述5×RT緩沖液由250m?mol?Tris-HCl、375mmol?KCl、15m?mol?MgCl₂、50m?mol?DTT組成。

4.如權利要求3所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述miRNA的特異逆轉錄引物由hsa-miR-9的特異逆轉錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉錄引物和內源性參照U6的特異逆轉錄引物組成；

所述hsa-miR-9的特異逆轉錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.35＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACAG-3＇；

所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.45＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3＇；

所述內源性參照U6的特異逆轉錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.55＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。

5.如權利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份：10×Taq緩沖液、10m?mol的MgCl₂、5單位/μL的Taq聚合酶、10m?moldNTP混合液、100mL無核酶水、10μmol特異正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探針；10×Taq緩沖液包括100m?mol?Tris-HCl，500m?mol?KCl。

6.如權利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述特異正向引物由hsa-miR-9的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內源性參照U6的特異引物組成；

所述hsa-miR-9的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.65＇-GGCTGCTCTTTGGTTATCTA-3＇；

所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.75＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇；

所述內源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.85＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。

7.如權利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-9檢測試劑盒，其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.95＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇。