[發(fā)明專利]一種芽孢桿菌及其篩選方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410040021.6
• 申請日: 2014-01-27
• 公開（公告）號: CN103789239A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 谷風林;陳永敢;李積華;賀書珍;徐飛;房一明;譚樂和
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/42;C12P7/24;C12P19/02
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;馮瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種芽孢桿菌及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

香草蘭原產(chǎn)墨西哥，屬蘭科攀緣藤本。香草蘭是高級食用香料，有“食用香料之王”之稱，豆莢含有2～3%的香蘭素，廣泛用于食品工業(yè)中。

香草蘭發(fā)酵豆莢的最主要風味物質(zhì)為香蘭素，其中香蘭素由其前體香蘭素葡萄糖苷經(jīng)豆莢自身攜帶的內(nèi)源β-D-葡萄糖苷酶水解而形成。β-D-葡萄糖苷酶屬纖維素酶類，能夠水解β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基，在自然界中分布非常廣泛。β-D-葡萄糖苷酶參與了生物體的糖代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。之前研究發(fā)現(xiàn)β-D-葡萄糖苷酶能將植物體內(nèi)的風味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風味的香氣物質(zhì)，因此在食品領(lǐng)域具有重要使用價值。

目前，已分離到多種產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的細菌，但是關(guān)于產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌，特別是分離自香草蘭的產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶芽孢桿菌未見有報道，而且這種菌株可應(yīng)用于香蘭素葡萄糖苷水解形成香蘭素。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種芽孢桿菌及其篩選方法和應(yīng)用，使得該菌株能夠水解香蘭素葡萄糖苷形成香蘭素，應(yīng)用于香蘭素的制備中。

本發(fā)明的另一個目的在提供一種水解香蘭素葡萄糖苷能力較強的芽孢桿菌。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種從香草蘭豆莢中分離得到的芽孢桿菌，命名為菌株XY18，菌株XY18在LB培養(yǎng)基上菌落呈圓形，乳白色，不透明，中間略微拱起。顯微觀察菌體為單胞，桿狀，有時成鏈，有鞭毛。革蘭氏染色陽性，芽孢橢圓或卵圓形。可以在含0-8%NaCl和pH4.0-8.0的LB培養(yǎng)基上20-45℃生長。

用細菌16S?rDNA通用引物A8-27f和B1523-1504r進行PCR擴增該菌株16S?rDNA序列，序列長度為1403bp（序列參見SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列）。提交GenBank，登陸號為KF986320。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對，結(jié)果表明，與菌株XY18同源性高的100株菌株均是芽孢桿菌屬（Bacillus?sp.），其同源性達99%以上。結(jié)合生理生化特征，鑒定其為芽孢桿菌屬（Bacillus?sp.）。

本發(fā)明所述芽孢桿菌已于2013年12月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.8629。

本發(fā)明所述芽孢桿菌以發(fā)酵后的香草蘭豆莢為材料，進行篩選純化，最終獲得了目的菌株，步驟如下：

步驟1、取發(fā)酵完成的香草蘭豆莢，置于無菌水中，充分震蕩后，將混合液涂布于LB平板培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，平板培養(yǎng)基上長出菌落后，挑取單菌落劃線純化培養(yǎng)獲得單一菌株；

步驟2、將步驟1獲得的純化后菌株接種于含七葉苷和檸檬酸高鐵氨的LB固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，挑取平板上產(chǎn)生黑色水解圈的菌落，獲得所述芽孢桿菌。

其中，作為優(yōu)選，步驟1所述LB平板培養(yǎng)基pH為7.0，每升包括10g?NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物以及15g瓊脂。

作為優(yōu)選，步驟2所述含七葉苷和檸檬酸高鐵氨的LB固體培養(yǎng)基pH為7.0，每升包括10g?NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、15g瓊脂、1g七葉苷和2.5g檸檬酸高鐵氨。

作為優(yōu)選，步驟1所述發(fā)酵具體步驟為：

取香草蘭豆莢熱水70℃殺青5min，殺青后豆莢50℃熱風發(fā)汗25h，然后再經(jīng)室溫干燥1個月，最后室溫陳香半年即完成發(fā)酵處理。

將本發(fā)明所述芽孢桿菌接種到以香蘭素葡萄糖苷為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基，香蘭素葡萄糖苷濃度為255mg/L，經(jīng)過20h的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中香蘭素葡萄糖苷濃度為0，被完全水解，同時培養(yǎng)基中檢測到香蘭素濃度為42.8mg/L，表明了本發(fā)明所述芽孢桿菌XY18在20h內(nèi)能夠?qū)舛葹?55mg/L的香蘭素葡萄糖苷完全水解，并且生成了香蘭素。由此本發(fā)明提供了所述芽孢桿菌在產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶、水解香蘭素葡萄糖苷和/或制備香蘭素中的應(yīng)用。

同時，本發(fā)明還提供一種制備香蘭素的方法，包括以下步驟：

配置以香蘭素葡萄糖苷為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基，將權(quán)利要求1所述芽孢桿菌接種于無機鹽液體培養(yǎng)基中，28℃170rpm搖床培養(yǎng)，即可獲得香蘭素。