[發明專利]桑螟β-呋喃果糖苷酶、編碼基因、基因載體、菌株及應用

有效

• 申請號: 201410031951.5
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103773748A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 孟艷;李靜;高俊山;戴偉宏;張蕾
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇銀創律師事務所 32242
• 代理人: 何震花

技術領域

本發明屬于昆蟲分子生物學和植物生物化學領域，具體涉及桑螟β-FFase基因DpSuc1a的擴增、全長cDNA的克隆和鑒定及其編碼蛋白的體外表達與酶活性分析。

背景技術

多種植物在機械性損傷或者昆蟲取食的部位滲出乳液或其他分泌物。大量研究表明這些乳液富含多種化學防護物質，如萜類、生物堿、類黃酮、類固醇等，其通過昆蟲的中腸發生作用，阻礙昆蟲的攝食或成長，進而在防御植食性昆蟲食害方面起重要作用。乳液因此被認為是與植物的抗蟲防御功能密切相關。

另一方面，植食性昆蟲進化出對植物的復雜的適應性，從分子、生理、行為方面抵御各種乳液的損害。桑樹是迄今為止被發現含有脫氧野尻霉素（DNJ）等糖類似生物堿的幾種高等植物之一，桑葉的乳液中含有高濃度的次生代謝產物生物堿。Konno等人的研究發現，桑葉乳液中所含的生物堿對一些鱗翅目昆蟲如寡食性的蓖麻蠶和多食性的甘藍夜蛾幼蟲具有強烈的毒害作用。

蔗糖水解酶有兩種：一種是從葡萄糖基一側起催化作用的α-葡萄糖苷酶，另一種是從果糖基一側水解蔗糖的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，β-FFase，在動物中鮮有報道）。研究表明，生物堿是α-葡萄糖苷酶的強效抑制劑，而對β-FFase沒有抑制作用。家蠶（Bombyx?mori）是以桑葉為唯一食物和糖營養來源的經濟昆蟲，家蠶的基因組中存在β-FFase基因（BmSuc1），其在幼蟲中腸中特異表達并被證實具有不受生物堿抑制的酶活性質。研究認為家蠶正是利用?β-FFase的功能充分分解吸收桑葉中的蔗糖營養，從而成功地避開了桑葉生物堿的毒害作用。

針對當前蠶桑產業的多元化發展趨勢和要求，桑樹不僅可以作為蠶的飼料來源，更為廣闊的是，桑樹還可以作為生態桑，用于治理石漠化，起到防沙護林和保護環境等多方面的作用。桑螟(Diaphania?pyloalis)是桑樹重要害蟲之一，對我國多省份夏秋季的桑樹為害相當嚴重。我們發現桑螟的中腸組織蛋白中含有β-FFase的酶活性，桑螟的基因組中同樣存在β-FFase的同源基因（DpSuc1a），該基因在桑螟的中腸被大量轉錄表達。本發明對桑螟的β-FFase基因的cDNA進行擴增、克隆和序列分析，通過體外表達重組DpSUC1a酶蛋白，鑒定了酶的活性功能。本發明的基因及其編碼蛋白對食桑害蟲抵抗桑樹生物堿的分子機制研究，以及進一步利用植物轉基因RNAi等技術開發新型抗蟲靶標具有重要的理論及實際意義，將在桑園害蟲防治和增強桑樹抗蟲性的研究中發揮重要的作用，應用前景廣闊。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種新的桑螟β-FFase基因DpSuc1a的編碼基因、擴增方法及擴增引物組，其編碼基因DpSuc1a的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

為實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了用于擴增桑螟β-FFase基因的引物組，由如下引物組成：

簡并引物：正向引物SUCdgpF如SEQ?ID?NO.3所示；

反向引物SUCdgpR如SEQ?ID?NO.4所示。

RACE引物：5’RACE外引物DpSuc1a-5RAgsp，如SEQ?ID?NO.5所示；

5’RACE內引物DpSuc1a-5RAngsp，如SEQ?ID?NO.6所示；

3’RACE外引物DpSuc1a-3RAgsp，如SEQ?ID?NO.7所示；

3’RACE內引物DpSuc1a-3RAngsp，如SEQ?ID?NO.8所示。

本發明還提供了桑螟β-FFase基因的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：獲得桑螟中腸的總RNA；

步驟2：反轉錄合成cDNA；

步驟3：以cDNA為模版，用簡并引物SUCdgpF和SUCdgpR為引物進行PCR，擴增得到中間序列；

步驟4：用RACE引物組擴增獲得桑螟β-FFase基因片段的5’端和3’端片段；

步驟5：將所述β-FFase基因cDNA序列的中間片段、所述β-FFase基因的5’端和3’端片段拼接，即得桑螟β-FFase基因的全長cDNA片段。

作為優選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。