[發明專利]紅錐SSR2標記、引物對及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410029917.4
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103740707A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 蔣燚;劉海龍;朱積余;黃榮林;姜英;何應會
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于生物科學中的分子標記技術領域，尤其涉及一種紅錐SSR2標記、引物對及其制備方法和應用。

背景技術

紅錐（Castanopsis?hystrix）為殼斗科(Fagaceae)栲屬(Castanopsis)常綠喬木，是華南地區重要的鄉土闊葉、優質珍貴用材樹種。它生長快、適應廣、效益高，可用做建筑、造船、高檔家具等；萌芽力強，枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可純林種植，亦可混交造林，是針葉樹種混交造林的最理想的伴生樹種之一；紅錐對生境適應能力強，在群落中位于喬木層，為優勢種，對于維持群落穩定具有重要作用，特別適宜人工營造用材林和水源涵養林。由于紅錐木材非常珍貴，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了嚴重破壞。

SSR標記（Simple?sequence?repeat），也叫微衛星序列重復，是由一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十乃至數百個核苷酸的重復序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復單位的次數的不同或重復程度的不完全相同，造成了SSR長度的高度變異性，由此產生SSR標記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛星區域特定順序設計成對引物，通過PCR技術，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點在不同個體間的多態性。SSR標記具有以下優點：（1）標記數量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；（2）是共顯性標記，呈孟德爾遺傳；（3）技術重復性好，易于操作，結果可靠。

盡管國內外的學者已經使用ISSR、RAPD等多種標記研究了紅錐群體的遺傳多樣性，紅錐群體的遺傳結構和不同種源紅錐間的遺傳關系和距離，但是ISSR和RAPD兩種標記均為顯性標記，穩定性差，且不能直接應用于分子標記輔助育種和QTL定位。因此，研究紅錐SSR標記、開發紅錐的SSR引物很有必要。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種紅錐SSR2標記、引物對及其制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：紅錐SSR標記，具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，微衛星標記編號為SSR2。

擴增上述紅錐SSR標記的引物對HZ2，包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的堿基序列。

上述紅錐SSR標記的制備方法，利用特定引物對HZ2對紅錐總DNA進行PCR擴增，得到簡單重復序列；引物對HZ2包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的堿基序列。

上述紅錐SSR標記的制備方法，包括以下步驟：

<1>紅錐總DNA提取與酶切

選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37℃下酶切3h，65℃下20min滅活內切酶；反應體系20μL，包括2.0μL的10×Buffer，1.0μL的EcoRV內切酶，2μL的DNA，15.0μL的滅菌雙蒸水；

<2>接頭的連接

將步驟<1>EcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；60μL連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA9μL，上下接頭各100pmol；連接反應在1倍T4連接酶緩沖條件下進行，于16℃連接過夜；連接后的混合物在65℃反應20min，滅活連接酶；

<3>連接產物的擴增

過夜步驟<2>連接后的混合物以AP2和復合SSR引物為上下引物對連接后的混合物進行PCR擴增；1.5%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化；

<4>克隆并篩選富集的微衛星DNA片段

將步驟<3>PCR產物連接到載體pMD18-T?Vectors上，然后轉化到感受態細胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養基上，37℃培養過夜；用M13引物進行PCR擴增檢測，選取400-1000bp左右的片段；

<5>測序、引物設計與擴增分析

將步驟<4>PCR產物送測序；利用Primer5.0軟件對測序結果進行SSR引物設計并送合成，得引物對HZ2；利用引物對HZ2在紅錐基因組中擴增出片段SSR2標記。