[發明專利]聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201410028821.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103808773A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉清君;盧妍利;姚瑤;王平;張迪鳴;張倩
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及一種傳感器件的制備技術，尤其涉及一種利用聚乙二醇固定桔小實蠅氣味結合蛋白的方法，以及利用桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器檢測水果揮發性氣味物質（β-紫羅蘭酮及乙酸異戊酯）的方法。?

背景技術

桔小實蠅是一種對多種果蔬具有很大威脅的害蟲，它的寄主范圍極廣，涉及到250多種果蔬。所以對于桔小實蠅的防治是農業、林業檢疫部門一項重要任務。針對桔小實蠅對水果氣味靈敏的感知特性，可以建立特殊水果氣味的傳感器用于桔小實蠅的防治。氣味結合蛋白是一種存在于桔小實蠅觸角嗅覺細胞外的低分子量疏水性蛋白。它能夠與目標氣味分子可逆地結合，起到運輸疏水性小分子的作用。桔小實蠅氣味結合蛋白容易獲取、結構穩定，可以作為生物敏感元件構建生物傳感器。利用桔小實蠅氣味結合蛋白和阻抗傳感器結合的優勢，發展一種基于電化學阻抗分析的桔小實蠅氣味結合蛋白生物傳感器，可以特異性的檢測水果揮發性氣味物質（β-紫羅蘭酮及乙酸異戊酯），可以用于食品成分快速檢測、昆蟲養殖及桔小實蠅等昆蟲防治等領域。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白電化學阻抗傳感器的制備及應用。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：其特征在于，包括以下步驟：

（1）加工圓線型叉指金電極阻抗傳感器：以玻璃為基底，在玻璃基底上磁控濺射鈦化鎢薄膜作為粘附層，接著磁控濺射金薄膜作為電極層；用AZ光刻膠光刻出圓線型叉指圖形，再采用干法刻蝕將非電極區域刻蝕掉，得到圓線型叉指金電極以及外接引腳，最后將芯片腔用環氧樹脂膠封在玻璃基底上，制得圓線型叉指金電極阻抗傳感器；

（2）固定桔小實蠅氣味結合蛋白，該步驟通過以下子步驟來實現：

（2.1）首先，將圓線型叉指金電極在由質量濃度為98%以上的濃硫酸和體積濃度為30%的雙氧水溶液按體積比為7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超純水沖洗3次以上，最后依次用無水乙醇和超純水清洗上述的圓線型叉指金電極，用氮氣吹干；

（2.2）配制濃度為1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶劑由無水乙醇和超純水按體積比3:7混合組成；將聚乙二醇溶液滴加在圓線型叉指金電極上至完全覆蓋圓線型叉指金電極，在室溫下靜置24h，聚乙二醇中的巰基與圓線型叉指金電極反應生成金硫鍵，進而將聚乙二醇固定于圓線型叉指金電極上，之后再吸出芯片腔的殘留的聚乙二醇溶液；

（2.3）分別加入體積均為聚乙二醇溶液一半的濃度為8mg/ml?的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）溶液和濃度為12mg/ml的NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶劑均為0.1M?MES緩沖液，15min后，再加入NaHCO₃溶液調節pH至7.2-7.4；

（2.4）然后加入與聚乙二醇溶液等體積的濃度為67?μg/ml?的桔小實蠅氣味結合蛋白溶液，桔小實蠅氣味結合蛋白溶液的溶劑為0.1M?PBS緩沖液，室溫下靜止2h，使得桔小實蠅氣味結合蛋白與聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成穩定的酰胺鍵，進而形成酰胺鍵結構，然后吸出芯片腔中殘留的液體，再向芯片腔中加滿0.1M?PBS緩沖液，靜置5min后吸出PBS緩沖液，用于清洗未被固定的桔小實蠅氣味結合蛋白，重復3次后即可獲得聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器，置于4℃條件下備用。

應用上述聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器檢測水果揮發性氣味物質的方法，包括以下步驟：

（1）配制待測水果揮發性氣味物質標準樣品溶液：采用物質的量濃度為0.01M待測的水果揮發性氣味物質的標準貯備溶液稀釋配制5種相應濃度梯度的標準樣品溶液；稀釋液為0.1M?PBS緩沖液；?