[發明專利]聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201410028821.6
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103808773A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 劉清君;盧妍利;姚瑤;王平;張迪鳴;張倩
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）加工圓線型叉指金電極阻抗傳感器：以玻璃為基底，在玻璃基底（1）上磁控濺射鈦化鎢薄膜作為粘附層，接著磁控濺射金薄膜作為電極層；用AZ光刻膠光刻出圓線型叉指圖形，再采用干法刻蝕將非電極區域刻蝕掉，得到圓線型叉指金電極（2）以及外接引腳（3），最后將芯片腔（7）用環氧樹脂膠封在玻璃基底（1）上，制得圓線型叉指金電極阻抗傳感器；

（2）固定桔小實蠅氣味結合蛋白，該步驟通過以下子步驟來實現：

（2.1）首先，將圓線型叉指金電極（2）在由質量濃度為98%以上的濃硫酸和體積濃度為30%的雙氧水溶液按體積比為7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超純水沖洗3次以上，最后依次用無水乙醇和超純水清洗上述的圓線型叉指金電極（2），用氮氣吹干；

（2.2）配制濃度為1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶劑由無水乙醇和超純水按體積比3:7混合組成；將聚乙二醇溶液滴加在圓線型叉指金電極（2）上至完全覆蓋圓線型叉指金電極（2），在室溫下靜置24h，聚乙二醇中的巰基與圓線型叉指金電極（2）反應生成金硫鍵，進而將聚乙二醇固定于圓線型叉指金電極（2）上，之后再吸出芯片腔（7）的殘留的聚乙二醇溶液；

（2.3）分別加入體積均為聚乙二醇溶液一半的濃度為8mg/ml?的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）溶液和濃度為12mg/ml的NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶劑均為0.1M?MES緩沖液，15min后，再加入NaHCO₃溶液調節pH至7.2-7.4；

（2.4）然后加入與聚乙二醇溶液等體積的濃度為67?μg/ml?的桔小實蠅氣味結合蛋白溶液，桔小實蠅氣味結合蛋白溶液的溶劑為0.1M?PBS緩沖液，室溫下靜止2h，使得桔小實蠅氣味結合蛋白與聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成穩定的酰胺鍵，進而形成酰胺鍵結構，然后吸出芯片腔（7）中殘留的液體，再向芯片腔（7）中加滿0.1M?PBS緩沖液，靜置5min后吸出PBS緩沖液，用于清洗未被固定的桔小實蠅氣味結合蛋白，重復3次后即可獲得聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器，置于4℃條件下備用。

2.一種聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白生物傳感器檢測水果揮發性物質的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）配制待測水果揮發性氣味物質標準樣品溶液：采用物質的量濃度為0.01M待測的水果揮發性氣味物質的標準貯備溶液稀釋配制5種相應濃度梯度的標準樣品溶液，稀釋液為0.1M?PBS緩沖液；?

（2）檢測水果揮發性氣味物質標準樣品溶液，建立水果揮發性氣味物質標準濃度-歸一化阻抗曲線：空白對照溶液電化學阻抗圖譜的測量：先將圓線型叉指金電極（2）的兩個外接引腳（3）分別通過導線（8）連接電化學工作站（9）的兩個輸入端，然后向芯片腔（7）內加入與聚乙二醇溶液等體積的氧化還原對溶液，氧化還原對溶液中含有10mM鐵氰化鉀、10mM亞鐵氰化鉀和0.1M的KCl，溶劑為超純水，再向芯片腔（7）中加入與氧化還原對溶液等體積的PBS緩沖液，以電化學工作站（9）作為儀器平臺對的聚乙二醇固定的桔小實蠅氣味結合蛋白傳感器進行電化學阻抗圖譜掃描，得到電化學阻抗圖譜和電子傳遞電阻，測量結束后吸出芯片腔（7）中上次測量殘留的全部溶液，然后加滿0.1M?PBS緩沖液，靜置5min后緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗圓線型叉指金電極（2），再進行水果揮發性氣味物質標準樣品溶液電化學阻抗圖譜的測量，向芯片腔（7）中加入等量的與聚乙二醇溶液等體積的氧化還原對溶液和某一物質的量濃度的水果揮發性氣味物質溶液，進行電化學阻抗圖譜的測量，得到該物質的量濃度下的水果揮發性氣味物質標準樣品溶液對應的電化學阻抗圖譜和電子傳遞電阻，測量結束后吸出芯片腔（7）中上次測量殘留的全部溶液，然后加滿0.1M?PBS緩沖液，靜置15min后緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗圓線型叉指金電極（2）；

（3）建立水果揮發性氣味物質溶液標準濃度-歸一化阻抗曲線：重復上述步驟2中空白對照溶液和水果揮發性氣味物質標準樣品溶液的電化學阻抗圖譜的測量過程，直至完成5種相應濃度梯度的水果揮發性氣味物質標準樣品溶液的測量，得到不同濃度下的電化學阻抗譜圖和電子傳遞電阻，計算歸一化阻抗（標準樣品溶液與空白對照溶液差值相對于空白對照溶液的變化值），得到水果揮發性氣味物質標準樣品溶液濃度與歸一化阻抗之間的關系曲線y=a^-bx，其中，x為水果揮發性氣味物質標準樣品溶液濃度，y為歸一化阻抗，a和b為常數，實現對水果揮發性氣味物質的檢測。