[發明專利]一種將人脂肪間充質干細胞誘導成胰島素分泌細胞的誘導劑、誘導培養基及方法

有效

• 申請號: 201410027180.2
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103756954A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張炳強;王秀芹;孫全偉;宋大鵬;孫玉萍
• 申請（專利權）人: 青島中天干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞的誘導劑、誘導培養基及方法。

背景技術

糖尿病(diabetes?mellitus，DM)是一種以糖脂代謝紊亂為主要特征的內分泌代謝性疾病。根據世界衛生組織和國際糖尿病聯盟公布的預測，到2030年，全球糖尿病患者將達3.7億。目前我國DM患者已超過4500萬，僅次于印度居第二位。盡管其病因不同，但都表現為胰島細胞數量及功能的缺陷，最終都需要使用胰島素進行治療。盡管由于胰島素的應用，尤其是近年來在胰島素劑型以及給藥途徑等方面均取得了一些進展，但實踐證明外源性胰島素并不能像人體自身分泌胰島素那樣完美地控制血糖并恒定維持血糖正常。細胞替代療法是治療糖尿病的重要方法，是一種更接近生理方式的有效方法，可實現對血糖進行持續監測和精細調節。近些年，經肝門靜脈植入胰島細胞治療糖尿病也獲得了一些療效，但胰島細胞移植面臨著兩個難題：供體來源不足及嚴重的免疫排斥反應。?

干細胞作為一種具有自我更新及多向分化的細胞，在一定條件下可分化為具有功能性的胰島細胞，因此可作為胰島細胞的全新來源。目前由干細胞分化獲得胰島細胞有三種途徑：1、胚胎干細胞分化；2、胰島干細胞或胰島前體細胞分化；3、成體干細胞分化。由于胚胎干細胞具有倫理爭議，且很難獲得胰島干細胞，而成體干細胞來源廣泛，無倫理爭議，可作為胰島細胞的來源。

脂肪組織中含有一類具有多向分化潛力的細胞，即脂肪間充質干細胞，簡稱脂肪干細胞。其生物學性質與骨髓間充質干細胞相類似，并可向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內皮、肝、胰島和神經等多種細胞方向分化。由于脂肪組織在人體內儲量豐富，獲取簡便創傷小，在組織工程、器官修復、基因治療等方面都有著廣闊的應用前景，因此脂肪間充質干細胞已成為繼骨髓間充質干細胞后干細胞領域另一個備受關注的熱點。

目前的干細胞誘導方式主要有體外誘導、基因修飾、蛋白轉導與組織微環境誘導，其中體外誘導是采用不同刺激因子組合，將干細胞誘導分化為目的細胞。各實驗室誘導分化條件各異，誘導分化機制尚不明確，誘導分化效率低，胰島分泌能力僅為正常胰島1%左右，且誘導過程復雜，誘導時間長，所得細胞數量少，功能低。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中存在的上述問題，提供一種將人脂肪間充質干細胞誘導成胰島素分泌細胞的誘導劑。該誘導劑成分安全無毒，誘導成功率高。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種將人脂肪間充質干細胞誘導成胰島素分泌細胞的誘導劑，由以下組分組成：大株紅景天注射液、煙酰胺、?；撬岷虶LP-1。

所述誘導劑各組分的質量濃度配比為：大株紅景天注射液20～40?g/L、煙酰胺0.97～1.47g/L、?；撬?.25～0.50?g/L，GLP-1?26.84～40.27mg/L。

本發明的第二個目的是提供一種含有上述誘導劑的誘導培養基，所述誘導培養基通過以下方法制備而成：每1000ml所述誘導培養基中含有大株紅景天注射液20～40?g、煙酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50?g、GLP-1?26.84～40.27mg，余量為人間充質干細胞無血清培養基，混勻過濾除菌即可。

本發明的另一個目的是提供一種將人脂肪間充質干細胞誘導成胰島素分泌細胞的方法，該方法包括以下步驟：

1、脂肪間充質干細胞的制備：將脂肪組織消化后，進行原代細胞培養、傳代培養；

2、脂肪間充質干細胞的鑒定：取P3代脂肪間充質干細胞，流式檢測細胞表面標記；

3、誘導人脂肪間充質干細胞分化為胰島細胞：傳3代的脂肪間充質干細胞，0.125%～0.01％Trypsin-EDTA溶液消化收集細胞，制備細胞懸液，細胞計數板計數活細胞密度，并調整密度1×10⁴/cm²，接種于事先放置有經多聚賴氨酸處理的消毒蓋玻片的24孔板內，制備細胞爬片。待細胞達接近80%融合，生長旺盛時用誘導劑進行誘導分化；

4、誘導后胰島細胞鑒定：（1）雙硫腙染色反應；（2）化學發光免疫分析法檢測胰島素水平；（3）ELISA試劑盒檢測誘導獲得的胰島樣細胞是否具有胰島素分泌功能；（4）葡萄糖刺激實驗；（5）動物模型體內移植實驗。