[發明專利]薄皮甜瓜中果肉蛋白質組分析方法

有效

• 申請號: 201410026620.2
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103760210A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 郝敬虹;黃雅芳;房克鳳;楊瑞;劉超杰;韓瑩琰;楊柳;王建立;張卿;宋婷婷;孫中華;于同泉;王紹輝;范雙喜
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 張秋云

技術領域

本發明屬于園藝作物蛋白質組分析領域，尤其涉及一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質組分析方法。

背景技術

甜瓜（Cucumis?melo.L）果實香甜，富含糖、淀粉，還有少量蛋白質、礦物質及其他維生素，作為一個優質高產的園藝作物，近年來越來越受到青睞。然而，目前關于甜瓜生長發育進程中蛋白質組的變化、不同生境下的差異蛋白質組以及外源物質調節的蛋白質組變化鮮見報道。特別是果實中蛋白質的含量和各種酶對果實發育過程中不同生理生化反應的作用，逆境條件下果實中蛋白質種類、功能及代謝的途徑，以及蛋白質磷酸化的作用機制等等方面的研究缺乏。這些都與實際生產存在密切關系，因此，研究甜瓜果實中的蛋白質組，并結合代謝組的研究探索果實發育模式及制定相應調控措施，將為創造高產、具有良好農藝特征的甜瓜提供美好的前景。

發明內容

本發明提供了一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質組分析方法，應用本發明的方法可以從薄皮甜瓜中果肉提取出較高純度的蛋白質，得到清晰、重復性好的圖譜，并且經過數據的分析能得出較多差異蛋白點，便于質譜分析。

????本發明提供的一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質組分析方法，是將薄皮甜瓜中果肉總蛋白質提取后，首先進行等電聚焦電泳，再進行SDS-PAGE凝膠垂直電泳。

優選地，所述薄皮甜瓜蛋白質提取是將薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-飽和酚提取，用含乙酸銨的甲醇溶液沉淀得到的。

此方法可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白質，避免大量糖分和其他有機質的影響。

進一步地，每1g薄皮甜瓜中果肉需要3~4?ml?Tris提取液和3~4?ml?Tris-飽和酚。

在此比例下可以最大量的溶解出樣品中的蛋白質，減少樣品和試劑的浪費。是提取甜瓜中果肉總蛋白的最優比例。

????所述Tris提取液和Tris-飽和酚的體積比為1：1。

優選地，所述等電聚焦電泳中使用24cm膠條。

選擇24cm膠條，是為了使蛋白質更好的分離，避免蛋白質點之間的重疊，使蛋白質點在膠上達到最大程度的分離。

進一步地，所述等電聚焦電泳中上樣量為800μg蛋白質，終上樣體積為450μl。

此上樣量是24cm膠條的最優上樣量，這樣蛋白點聚焦好，無橫紋和豎紋，分離徹底，能夠得到清晰的蛋白質圖譜。

優選地，所述等電聚焦電泳后包括膠條平衡的步驟，所述膠條平衡分兩步，每步20min。

每步平衡20min，可以保證每步的平衡完全徹底，又不會造成過度平衡。

優選地，在所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳中，先1W?/塊跑1h，瓊脂糖形成一條直線后，調成5W/塊跑8h。

前1h以內選擇1W/塊膠的功率跑膠，可以使蛋白質在低功率下均勻平穩的從膠條上轉移到膠上，然后選擇較高的功率跑膠，使不同的蛋白質達到快速高效的分離。

優選地，所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳后包括固定、染色、脫色的步驟，在固定后用純水清洗，所述染色時間為24小時。

本發明提供了一種經濟、簡便、易行、快速的適用于薄皮甜瓜中果肉的總蛋白的提取及雙向電泳方法。本發明使用Tris/酚提取-甲醇乙酸銨沉淀法提取蛋白質，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白質，減少大量糖分和其他有機質的影響。目前，經反復實驗證明：實驗樣品制備全、2-DE電泳操作簡單、且圖譜清晰、重復性好、試劑毒性較低、結果可靠，可為葫蘆科園藝作物蛋白質組學研究提供技術范例，是一套適用于薄皮甜瓜中果肉蛋白質組分析的雙向電泳技術。

附圖說明

圖1為上樣量為500μg蛋白質，使用不同pH范圍的膠條進行等電聚焦電泳，再進行凝膠垂直電泳后的圖譜比較；其中，圖1A使用的是pH3-10，24cm膠條；圖1B使用的是pH4-7，24cm膠條；

圖2為使用pH4-7，24cm膠條時，不同蛋白質上樣量進行等電聚焦電泳，再進行凝膠垂直電泳后的圖譜比較；其中，圖2A的上樣量為500μg蛋白質；圖2B的上樣量為800μg蛋白質。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。如未特殊說明，“%”為質量百分比。

薄皮甜瓜雖然包括許多品種，但是品種間果實中糖類、膠質、酚類等物質的成分和含量相差不多，因此本發明的方法適用于薄皮甜瓜的所有品種。