[發明專利]一種蝦青素合成基因重組質粒及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410022774.4
• 申請日: 2014-01-17
• 公開（公告）號: CN103805623A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張利平;湯暉;孔敏;于淼
• 申請（專利權）人: 河北大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68;C12Q1/32;C12Q1/25;C12Q1/26
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及重組質粒及其制備方法和用途，具體的說是一種蝦青素合成基因重組質粒及其制備方法和用途。

背景技術

蝦青素是一種非維生素A源的酮式類胡蘿卜素。近年來的藥理學和生理學研究發現蝦青素具有極強的生物抗氧化性,此外,還具有促進抗體產生、增強免疫力以及抗紫外線輻射等作用,因而在醫藥、食品、水產業、化妝品等方面有著廣闊的應用前景。目前,蝦青素的生產方法主要有化學合成法、蝦殼類提取、生物技術法。由于化學合成工藝復雜,而蝦殼類廢棄物中蝦青素的含量低,因此化學合成法、蝦殼類提取法的生產成本均比較高。生物技術法通常是利用紅發夫酵母和雨生紅球藻生產蝦青素,現有研究大量集中在高產菌株的選育、廉價培養基的利用、培養條件的優化等方面。不過傳統菌種選育方法（如：原生質體融合,物理誘變、化學誘變等方法雖然易操作,并可在一定程度上提高細胞內的蝦青素含量,但隨機性大,方向性差。近年來，通過使用特異性抑制劑，紅球藻中蝦青素的生物合成途徑已基本清楚，其合成途徑通常是由丙酮酸鹽(pyruvate)和3一磷酸甘油醛(glyceraldehyde，3-P)從頭合成，先形成五碳的異戊烯焦磷酸(Isopentenypyrophosphate，IPP)，再轉化成同分異構體的二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallylpyrophospbate，DMAPP)。由三分子的DMAPP和一分子的IPP(isopenteny?pyrophosphate)經三步縮合反應形成廿碳的GGPP(geranylgeranyl?pyrophosphate)。在八氫番茄紅素合成酶(crtB>的作用下，2分子的GGPP縮合形成四十碳的八氫番茄紅素(phytoene)。八氫番茄紅素在八氫番茄紅素去飽和酶（crtI）和‘一胡蘿卜素去飽和酶(ZDS)的催化下，經4步脫氫去飽和反應形成番茄紅素(1ycopene)，番茄紅素在番茄紅素B環化酶（crtY）的作用下，進一步環化后形成B一胡蘿卜素。B一胡蘿卜素c3’和C4’分別經過羥基化和酮基化最終形成蝦青素。B一胡蘿卜素可以先在C一3，3’位羥基化形成中間產物B～隱黃質(B-Cryptoxanthin)和玉米黃素，再在C-4位氧化形成中問產物3一二羥基一2一酮一B一胡蘿卜素(Adonixanthin)，進一步氧化Adonixanthin最后形成蝦青素。9一胡蘿卜素也可以先在c-4，4’氧化形成中間產物海膽酮(Echinenone)和角黃質，再在C-3位羥基化形成中間產物4_二酮一3一羥基一B一胡蘿卜素(Adonimbuin)，進一步將Adonimbuin在C一3’位羥基化形成蝦青素。其中B一胡蘿卜素酮化酶(Crt再或CrtO)和B一胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)分別控制B一胡蘿卜素的酮基化和羥基化過程。目前編碼蝦青素合成路線中的27種不同的酶的150多個基因已經從細菌、植物、藻類和真菌的細胞中克隆出來，因此通過構建蝦青素生物代謝工程合成蝦青素逐漸受到研究人員的青睞。目前蝦青素生物代謝工程或是是對將外源蝦青素合成基因導入本身不合成蝦青素的受體,以形成蝦青素合成酶的高效表達，或是通過對本身可以合成蝦青素的雨生紅球藻或紅發夫酵母等為代謝工程的受體,通過改變蝦青素合成酶的數量、活力以及調控機制,實現蝦青素的高效表達。由于蝦青素在微生物體內的合成步驟多且復雜，因此研制能夠高效表達蝦青素多種合成酶的載體成為人們研究的熱點和難點。另外，研究人員對研發過程中目標受體蝦青素合成代謝途徑中主要酶系的功能的檢測也存在很多困惑，如通過離體的生化反應或利用基因突變株進行功能互補的方法進行檢測，其操作步驟比較繁瑣，并且效率也不高。因此如何獲得一種高效檢測目標受體蝦青素合成酶活性的方法亦是本領域研究人員所關注的問題。

發明內容

本發明的目的之一就是提供一種高效表達蝦青素多種合成酶的重組質粒，以期能夠準確、快速構建出蝦青素生產菌株；本發明的目的之二就是提供該重組質粒的一種制備方法；本發明的目的之三就是提供一種該重組質粒的用途，即所述重組質粒在檢測蝦青素合成主要相關基因的功能中的應用，更具體地說是蝦青素合成基因重組表達質粒pET-Ast在檢測目標受體蝦青素合成酶活性中的應用。

本發明的目的是按如下的技術方案實現的：

本發明所提供的蝦青素合成基因重組表達質粒pET-Ast，其攜帶有crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtS基因和crtR基因，該重組表達質粒的結構如圖1所示；