[發明專利]一種蝦青素合成基因重組質粒及其制備方法和用途有效
| 申請號： | 201410022774.4 | 申請日： | 2014-01-17 |
| 公開（公告）號： | CN103805623A | 公開（公告）日： | 2014-05-21 |
| 發明（設計）人： | 張利平;湯暉;孔敏;于淼 | 申請（專利權）人： | 河北大學 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68;C12Q1/32;C12Q1/25;C12Q1/26 |
| 代理公司： | 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112 | 代理人： | 白海靜 |
| 地址： | 071002 *** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 蝦青素 合成 基因 重組 質粒 及其 制備 方法 用途 | ||
1.一種蝦青素合成基因重組表達質粒pET-Ast，其特征在于所述重組表達質粒攜帶crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtS基因和crtR基因，該重組質粒的結構如圖1所示?。
2.根據權利要求1所述的蝦青素合成基因重組表達質粒pET-Ast，其特征在于所處重組表達質粒pET-Ast的堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示。?
3.一種蝦青素合成基因重組表達質粒pET-Ast的制備方法，其特征包括如下步驟：?
Ⅰ）基因擴增：?
提取Pantoea?agglomerans?ACCC10495的基因組DNA，采用PCR擴增crtE、crtB、crtI、crtY基因編碼框，相應引物分別為P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8：?
所述P1的堿基序列為5’-CAGCATATGATGGTGAGTGGCAGT-3’?
所述P2的堿基序列為5’-TTAATTGTTAACTCAGGCGATTTTCAT-3’?
所述P3的堿基序列為5’-TTAATTGTTAACATGAGCCAACCGCCG-3’?
所述P4的堿基序列為5’-GGGCCCCAATTGCTAAACGGGACGCTG-3’?
所述P5的堿基序列為5’-GGGCCCCAATTGATGAAAAAAACCGTT-3’?
所述P6的堿基序列為5’-GGAATTCGCTAGCGAATTTCAGGCTGGCGGTGG-3’?
所述P7的堿基序列為5’-GGAATTCGCTAGCGAATTGTGAGGGATCTGATT-3’?
所述P8的堿基序列為5’-CCCTTTAAAGGGTCATCCTTTATCTCG-3’；?
選用RNA提取試劑盒提取Phaffia?rhodozyma?CGMCC2.1557的總RNA，以HiFi-MMLV??cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄得cDNA第一鏈，采用RT-PCR擴增crtS、crtR基因編碼區，相應引物為P9/P10、P11/P12：?
所述P9的堿基序列為5’-CCCTTTAAAGGGATGTTCATCTTGGTC-3’?
所述P10的堿基序列為5’-CTAGTGCACTAGTCATTCGACCGGCTT-3’?
所述P11的堿基序列為5’-CTAGTGCACTAGATGGCCACACTCTCCGAT-3’?
所述P12的堿基序列為5’-ATTGCGGCCGCCTACGACCAGACGTCCATC-3’；?
Ⅱ）構建克隆質粒：?
將crtE、crtB、crtI、crtY、crtS、crtR的擴增產物分別進行1.5%凝膠電泳，然后分別回收924bp、930bp、1459bp、1161bp、1674bp、2825bp處的條帶，然后分別與克隆載體pMD18-T連接、轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆,發酵后提取得到pMD18-crtE、pMD18-crtB、pMD18-crtI、pMD18-crtY、pMD18-crtS和pMD18-crtR克隆質粒；?
Ⅲ）構建重組表達質粒pET-Ast：?
陽性克隆質粒分別進行雙酶切，驗證基因序列與載體連接的方向：pMD18-crtE以Nde?Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切；pMD18-crtB以HpaⅠ和EcoRⅠ雙酶切；pMD18-crtI以MfeⅠ和EcoR?Ⅰ雙酶切；pMD18-crtY以NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切；pMD18-crtS以AhaⅢ和EcoRⅠ雙酶切；pMD18-crtR以ApaLⅠ和EcoRⅠ雙酶切，選取基因序列與pMD18-T反向連接的克隆質粒；?
將篩選得到的pMD18-crtE和pMD18-crtB經HpaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接得pMD18-crtEB；將酶切連接得到的pMD18-crtEB和pMD18-crtI經MfeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接得pMD18-crtEBI；將酶切連接得到的pMD18-crtEBI和pMD18-crtY經NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切連接得pMD18-crtEBIY；將酶切連接得到的pMD18-crtEBIY和pMD18-crtS經AhaⅢ和EcoRⅠ雙酶切連接得pMD18-crtEBIYS；將酶切連接得到的pMD18-crtEBIYS和pMD18-crtR經ApaLⅠ和EcoRⅠ雙酶切連接得pMD18-crtEBIYSR；?
將表達載體pET-28a經SnaⅠ和BglⅡ酶切，將切口補平連接得載體pET-28a-SB；?
將質粒pMD18-crtEBIYSR和載體pET-28a-SB經NdeⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產物連接、轉化大腸桿菌DH5α，得到重組表達質粒pET-Ast。?
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