[發(fā)明專利]桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子及活性分析

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410020506.9
• 申請(qǐng)日: 2014-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN103820448A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚慶利;楊晨;潘怡歐;席景會(huì);畢銳;楊巽;辛雪成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一段DNA序列，它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)。具體涉及一種來(lái)源于桃蚜P450基因CYP6CY3并在細(xì)胞中高度表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。?

背景技術(shù)

桃蚜是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，通過取食和病毒傳播來(lái)危害農(nóng)作物。吡蟲啉是能有效防治桃蚜的新煙堿類殺蟲劑，但是田間種群已經(jīng)對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了不同水平的抗性。Puinean等(2010)研究表明桃蚜CYP6CY3超量表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生高水平抗性。這可能是桃蚜利用吡蟲啉作為化學(xué)感應(yīng)信號(hào)來(lái)啟動(dòng)其耐受機(jī)制進(jìn)而應(yīng)對(duì)吡蟲啉脅迫的重要生理機(jī)能。這也顯示出桃蚜CYP6CY3基因啟動(dòng)子極可能具有較高誘導(dǎo)活性，迄今為止，未有從桃蚜中分離的高活性啟動(dòng)子。目前能應(yīng)用于真核表達(dá)研究的桃蚜啟動(dòng)子還未有。因此，對(duì)于新的高活性的桃蚜相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要意義。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來(lái)源于桃蚜P450基因CYP6CY3。?

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的CYP6CY3啟動(dòng)子真核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因CYP6CY3的啟動(dòng)子序列和5'非翻譯區(qū)。?

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，該載體的表達(dá)能反映啟動(dòng)子活性的高低。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了桃蚜P450基因CYP6CY3的啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，所述載體包含帶有CYP6CY3基因的5'非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在Sf9細(xì)胞中表達(dá)，并檢測(cè)到該啟動(dòng)子的高水平活性。?

本發(fā)明提供一種獲得的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如SEQ?ID?NO:1所示，其中SEQ?I?DNO：1的-1bp至-2230bp區(qū)（見序列表）為桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子DNA序列，在真核細(xì)胞中本發(fā)明所述的啟動(dòng)子高水平活性。?

獲得的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列源自桃蚜P450基因CYP6CY3。?

SEQIDNO:1的+1bp至+71bp區(qū)（見序列表）為桃蚜P450基因CYP6CY3的5’非翻譯區(qū)的DNA序列，本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3基因的5'非翻譯區(qū)能在Sf9細(xì)胞中通過增強(qiáng)目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。?

為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列。?

上述用于Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)載體是指能夠在細(xì)胞中瞬時(shí)、高水平表達(dá)外源基因的?載體。例如pGL3載體、pGL4載體。?

一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，所述真核細(xì)胞表達(dá)包含桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列。?

關(guān)于本發(fā)明所述的用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體（pGL3），所述的桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)在表達(dá)載體中位于外源基因（Luc+）的前面。本發(fā)明提供通過插入本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)至含有Luc+報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)。但是，所述Luc+報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來(lái)代替。?

本發(fā)明提供來(lái)自桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)使得能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行高水平的表達(dá)。?

本發(fā)明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。?

附圖說(shuō)明

圖1為桃蚜基因組電泳圖?

圖2為Genome?walker?PCR電泳圖?

圖3為CYP6CY3連T載酶切鑒定電泳圖?

圖4為CYP6CY3連pGL3PCR鑒定電泳圖?

圖5為CYP6CY3連pGL3酶切鑒定電泳圖?

圖6為pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后啟動(dòng)子活性檢測(cè)?

圖7為pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)表達(dá)載體示意圖?

具體實(shí)施方式