[發明專利]培養胎盤間充質干細胞的無血清培養基

有效

• 申請號: 201410018678.2
• 申請日: 2014-01-13
• 公開（公告）號: CN103805562A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 章毅;陸瑤;洪艷;霍思維
• 申請（專利權）人: 章毅;中國干細胞集團上海生物科技有限公司;重慶市干細胞技術有限公司;陜西省干細胞技術有限公司;蘇州市干細胞技術有限公司;上海市干細胞技術有限公司;三亞市干細胞技術有限公司;中國干細胞集團上海有限公司;中國干細胞集團重慶有限公司;中國干細胞集團陜西有限公司;中國干細胞集團三亞有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 包文超

技術領域

本發明涉及一種用于細胞培養的組合物，尤其涉及一種培養干細胞的組合物，以無血清方式培養胎盤間充質干細胞。

背景技術

間充質干細胞（Mesenchymal?Stem?Cells，MSCs）是干細胞的一種類型，具備干細胞的兩個重要特征：很強的自我增殖能力和多分化潛能。MSCs起源于中胚層，理論上講它可以向中胚層組織分化。人類的間充質干細胞最早是從骨髓中分離出來的，在體內和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經細胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力（J.Orthop.Res.,1991,641-650；Science,1999,28,143-147）。

最新的研究表明間充質干細胞具有免疫調節和造血支持作用，而且易于外源基因導入表達。因此間充質干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構建中的種子細胞，基因治療中重要的載體細胞，而且由于間充質干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血干細胞移植和器官移植中具有廣泛的應用前景。間充質干細胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養出間充質干細胞。

目前所報道的間充質干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經歷一個比較痛苦的手術，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每10⁵～10⁶個單個核細胞中大約只有1個，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質干細胞的數量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應用尤其是臨床應用中受到限制。起源于胚胎發育期胚外中胚層的胎盤是由間質、血管及滋養細胞組成，含有大量的間充質成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，從胎盤中分離培養出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的來源。

中國發明專利申請200810061267.6公開了一種胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養方法，將收集自胎盤母體側蛻膜的組織細胞后，先進行原代細胞的貼壁擴增，再行正、負向免疫分選相結合的方法以純化胎盤間充質干細胞，獲得CD34^-CD105⁺細胞，在無血清體外培養體系中繼代擴增培養。

中國發明專利ZL200910117522.9公開了一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細胞的方法，首先將胎盤、臍帶或脂肪組織與磷酸緩沖液按2.5～4∶1的重量比混合放入組織粉碎桶中，粉碎后加入膠原酶混勻，在37℃左右條件下孵育、過濾和加入沉淀劑后，吸取上清液，離心，除去上清液，將濃縮的細胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖400^#的液體，再離心，收取中間10-15ml的細胞層，用細胞保養液清洗，將收集的細胞計數合格后即可使用。

中國發明專利申請201110005964.1公開了一種從胎盤中提取原始間充質干細胞及無血清擴增的方法，將獲取的新鮮的流產胎盤立即進行放血，采用生理緩沖液清除胎盤組織和臍帶外表的透明質粘液和母血污染；用生理緩沖液灌注，以去除血細胞和組織碎片；將胎盤小葉剪碎，用膠原酶消化，收集細胞成分，通過貼壁篩選法純化間充質干細胞。

現有的這些技術方案大都從胎盤中分離干細胞，從而建立胎盤干細胞庫，尚有諸多缺點，主要體現在純度和/或獲取的細胞數量等幾方面，以致尚難以滿足人們的期待。

此外，從組織中提取并獲得間充質干細胞之后，對間充質細胞的培養，仍需添加胎牛血清進行貼壁培養，也尚沒有適合產業應用的培養基，這在成本以及后續臨床試驗中增加了成本和風險，需要進一步探索。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種培養胎盤間充質干細胞的無血清培養基，以無血清方式實現胎盤間充質干細胞體外培養。

本發明的另一個目的在于提供一種以無血清培養基培養胎盤間充質干細胞的方法，以有效地提高胎盤間充質干細胞的體外分離和制取效率。

本發明提供的一種培養胎盤間充質干細胞的無血清培養基，以DMEM（Dulbeco’s?Modified?Eagle?Medium）培養液為基礎，還含有成纖維細胞生長因子受體2（Fibroblast?Growth?Factor2，FGF-2）、生長激素、胰島素、轉鐵蛋白（TF）、谷胱甘肽、骨形態發生蛋白4（Morphogenetic?protein-4，BMP-4），以及L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉（sodium?pyruvate）、非必需氨基酸和β-巰基乙醇等。