[發明專利]一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體pCAMBIA2300-CP與轉基因方法

有效

• 申請號: 201410012168.4
• 申請日: 2011-10-17
• 公開（公告）號: CN103947461A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 白描;楊國順;鐘曉紅;熊興耀;鄧子牛;石雪暉;陳文婷;周敏
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: A01G1/06
• 分類號: A01G1/06;C12N15/63;C12N1/20
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

母案第一次和第二次審查意見通知書中，審查員指出母案存在多項發明，不具備單一性，因此申請人決定對母案中未獲得保護的發明進行分案申請。本申請為申請號201110315208.9（發明名稱：一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉基因方法）的分案申請。?

技術領域

本發明涉及植物轉基因技術及其應用，特別是一種使番茄接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉基因方法。?

背景技術

植物病毒是導致果樹、蔬菜、花卉等園藝植物產量下降和品質變劣的重要原因,在農業生產中病毒病是僅次于真菌的第二大類病害,由于防治困難,素有“植物癌癥”之稱。目前植物病毒常用的防治措施有消滅病毒源和傳統媒介、應用脫毒技術、藥劑防治與選育抗病品種等，其中選育抗病品種是防治病毒病害最有效、最經濟的方法。RNA干擾技術為基礎的植物抗病技術因其高效性、特異性等特點，在植物抗病毒育種上展現了可觀的前景。?

基因沉默或稱RNA干擾(RNA?interference；RNAi)是指由于轉基因序列或外侵病毒與被沉默的內源或外源基因序列具有高度的同源性，其轉錄產物形成雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)結構，從而特異性地降解同源靶基因mRNA，使之發生沉默（Fire?A.,Xu?S.,Montgomery?M.K.,et?al.Potent?and?specific?genetic?interference?by?double-stranded?RNA?in?Caenorhabditis?elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811）。由于其干擾作用是發生在靶基因的轉錄后水平，因此，也成轉錄后基因沉默（post-transcriptional?gene?silencing；PTGS）。植物RNAi具有特異性、高效性、系統性以及可遺傳性等特點。可利用RNAi技術進行基因功能研究；或直接利用RNAi創造的特殊性狀變異體進行植物改良。其中RNAi技術在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸（如病毒）入侵的防御機制，同時現有研究進一步表明病毒產生交叉保護是由于誘導病毒（弱株系）所產生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒（強株系）的結果（Frank?G.R.,Stuart?A.M.and?David?C.B.Gene?Silencing?without?DNA:RNA-Mediated?Cross-Protection?between?Viruses[J].Plant?Cell,1999,11:1207-1216）。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是：選擇一段植物病毒基因的序列，以反向重復序列的方式構建成轉錄后含發夾結構的雙鏈RNA（hairpin?RNA，hpRNA）或含內含子的ihpRNA（intron-hairpin?RNA）表達載體，通過基因槍、病毒載體轉染或者農桿菌介導轉化整合到植物基因上，體內表達dsRNA，直接或間接誘導RNAi的產生，起到抵抗病毒的目的。而在發夾結構研究中，認為ihpRNA表達載體比hpRNA表達載體沉默效率高（Helliwell?C,Waterhouse?P.Constructs?and?methods?for?high-throughput?gene?silencing?in?plants?[J].Methods,2003,30（4）:289-295）。?

園藝植物種類與品種繁多，通過營養繁殖途徑繁衍的園藝植物后代普遍經受著病毒的威脅。目前生產中栽培的眾多蔬菜，水果和花卉均有幾十到上百個品種，幾乎每個品種都有數種到數十種病毒病害，病毒病抑制了植物的生長、結果，降低了果品的產量、質量，甚至引起死樹，植物一旦被病毒侵染,將終生帶毒持久受害。利用基因工程技術針對每一個品種進?行改良，提高其抗病毒的能力，雖可行但需花費大量的人力與財力。嫁接是許多園藝植物繁殖的方法之一，絕大多數的果樹和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品種的優良性狀，又能利用砧木的有利特性。在應用嫁接繁殖時，一般同一種類中的不同品種采用同一砧木，甚至有些同屬中的不同種類也采用同一砧木。這樣一砧多用的情況，使得改良砧木品種比單獨改良接穗品種要高效的多。?