[發明專利]一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒

有效

• 申請號: 201410012003.7
• 申請日: 2014-01-12
• 公開（公告）號: CN103789450A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 陳瑜;李蘭娟;謝國良;崔大偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

????本發明屬生物技術領域，涉及熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及一種一步法雙重實時熒光定量RT-PCR在同一個反應管內檢測患者糞便標本中柯薩奇病毒A2、A5型的核酸檢測方法，可應用于柯薩奇病毒A2、A5型引起暴發疫情的實驗室應急診斷、快速篩查、臨床診斷及手足口病的流行病學的研究。?

背景技術

手足口病(hand，foot?and?mouth?disease，HFMD)是由人類腸道病毒(human?enterovirus，?

HEV)引起的，以手、足、口、臀部出現皮疹癥狀為主要臨床癥狀的常見傳染病，主要以輕癥為主，但重癥及死亡病例也時有報道。人類腸道病毒分為A、B、C、D?4個組，目前共有90?多種基因型，其中最主要的病原體是HEV-A組中的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackie?virus?A16，CVAl6)。但越來越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA6、CVA10、CVA2、CVA5型等也可引起HFMD。

????導致手足口疾病的致病病原的變異變遷必須引起足夠的重視。比如，近年來在歐洲及我國周邊部分國家爆發的手足口病疫情中，柯薩奇病毒A6型等已經替代EV71和CVA16被作為主要致病病原體檢出。2010年，臺灣地區的手足口致病病原調查中，柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型有一定比例的檢出。2012年，香港地區報道2例柯薩奇病毒A2型引起的兒童死亡。而近年來，在我國的廣東深圳和山東臨沂等地區的手足口病原中也有柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型檢出的報道。在我們實驗室開展的2013年部分月份手足口病原調查中，柯薩奇病毒A2型和A5型也占到了一定的比例。目前我國的手足口病病原診斷市場，仍然以檢測腸道病毒通用型或腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型為主，導致手足口病病原體檢測不明確或漏檢等，造成患者治療的延誤及診斷試劑的浪費等。因而開發一種針對柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型病原檢測的診斷試劑對明確致病病原有極大的幫助。?

實時熒光定量PCR技術以其全封閉單管擴增、簡便快捷、重復性好、實時定量、污染少等優勢，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床診斷提供了準確可靠的實驗室依據，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測手段。?

發明內容

????本發明的目的是提供一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，是一種用柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型檢測的一步法雙重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。本試劑盒包含定量RT-PCR反應液、酶混合液、引物探針混合液、標準品（CVA2、CVA5）、強陽性對照品（CVA2、CVA5）、弱陽性對照品（CVA2、CVA5）、陰性對照品。?

其中定量RT-PCR反應液包含有PCR反應緩沖液（含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等），酶混合液含耐熱Taq?DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉錄酶，引物探針混合液包含CVA2、CVA5兩組引物和相應的CVA2、CVA5兩種不同熒光標記的探針，陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，CVA2、CVA5強陽性對照品和CVA2、CVA5弱陽性對照品為包含CVA2、CVA5的保守區基因序列的陽性質粒樣品。?

引物探針混合液需保存于棕色管。?

????雙重熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性探針序列如下：?

上游引物CVA2-F:?5’-?AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3’，

下游引物CVA2-R：5’-TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，

特異性探針CVA2-P:?5’-FAM-?AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，

上游引物CVA5-F:?5’-?AAGCGGCGGAGACAGGAG-3’，

下游引物CVA5-R:?5’-?CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，

特異性探針CVA5-P:?5’-HEX-?CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，

????其中CVA2、CVA5的特異性探針分別采用FAM、HEX兩種不同熒光標記。

上述CVA2、CVA5標準品的保守區基因序列如下：?

CVA2標準品序列為：