[發(fā)明專利]一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410010283.8
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN103757054A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉明;劉春國;相文華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K48/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應(yīng)用，尤其涉及一種預(yù)防和治療H3N8亞型馬流感的重組腺病毒活載體馬流感基因工程疫苗及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

馬流感(Equine?influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒中的馬流感病毒(Equine?influenza?virus，EIV)引起的馬屬動物一種嚴(yán)重的常見上呼吸道急性高度接觸性傳染疾病，多呈暴發(fā)性流行，傳播非常迅速而且廣泛。OIE規(guī)定EI為法定報告動物疫病，我國將其列為三類傳染病。

目前流行的EI主要為H3N8亞型，然而由于各種壓力H3N8亞型EIV也在不斷發(fā)生變異導(dǎo)致多個譜系病毒的出現(xiàn)，而且EIV已經(jīng)跨越種間障礙，犬和豬感染EIV事件的發(fā)生，使得EI的防控具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。近年來EI頻繁暴發(fā)，自2003年以來，在英國及其他歐洲國家和美國經(jīng)常有EI暴發(fā)的報道。此外，其他很少發(fā)生EI疫情的地區(qū)也已受到影響，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴發(fā)了EI疫情。澳大利亞這樣從未發(fā)生過EI的國家于2007年也遭受了EI的襲擊。

我國大陸地區(qū)一直以來都是EI的高發(fā)區(qū)。自建國以來我國共發(fā)生5次EI疫情。2007-2008年，我國暴發(fā)了第四次EI疫情，給我國的養(yǎng)馬業(yè)及即將興起的賽馬業(yè)以沉重的打擊。疫情首先在新疆暴發(fā)，隨后蔓延至全國各地。2007年從新疆疫情中分離到一株H3N8亞型EIV，命名為A/Equine/Xinjiang/3/07(H3N8)（XJ3）。2009年在廣西省以及2011年在貴州省也暴發(fā)了小規(guī)模EI疫情。自1974年我國首次暴發(fā)EI以來，除了海南，臺灣和福建不曾有文獻(xiàn)報道外，我國EI的分布幾乎遍及大江南北。

當(dāng)前疫苗接種是控制EI的效策略。我國曾開展EI疫苗研制工作，但這些疫苗早已不用，一旦EI發(fā)生后，主要采取一些對癥治療措施。目前我國所用疫苗都依賴于國外引進(jìn)，主要是法國Merial公司生產(chǎn)的重組金絲雀活載體疫苗Proteq-Flu1。在2008年北京奧運(yùn)馬術(shù)比賽舉辦之際，為了預(yù)防EI，我國不得不從國外引進(jìn)EI疫苗進(jìn)行緊急預(yù)防接種。對我國分離的H3N8亞型EIV的序列分析表明：我國流行的EIV屬于美洲譜系佛羅里達(dá)2群，而我國所使用的疫苗Proteq-Flu1所對應(yīng)的美洲譜系疫苗株屬于肯塔基亞譜系，兩者比較，在HA基因上有15個位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了變異，其中有8個分別位于A、B和C抗原區(qū)上，這警示我國的EIV正在進(jìn)行變異，而且實(shí)驗也證實(shí)進(jìn)口疫苗對我國EI不能夠提供完全保護(hù)。基于進(jìn)口疫苗的昂貴價格，以及抗原針對性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，開發(fā)一種擁有我國自主知識產(chǎn)權(quán)、保護(hù)性良好的新型高效EI基因工程活載體疫苗具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗，具體涉及一種預(yù)防和治療馬流感（EI）的重組復(fù)制缺陷型腺病毒活載體馬流感基因工程疫苗，這種疫苗是以EIV?XJ3囊膜糖蛋白HA作為保護(hù)性抗原的E1和E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-XJ3-HA。

本發(fā)明以E1和E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人腺病毒為載體，在E1區(qū)攜帶有EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，或者與SEQ?IDNO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或者它們的片段。

本發(fā)明的疫苗是以人腺病毒5型（ATCC?VR5）為載體，將其缺失部分早期基因表達(dá)E1編碼區(qū)（△481-3533bp）和E3編碼區(qū)（△28130-30820bp），外源HA基因通過在大腸桿菌內(nèi)同源重組整合入E1編碼區(qū)。

本發(fā)明的疫苗中，所述的EIV囊膜糖蛋白，來源于我國流行的現(xiàn)地分離株XJ3HA基因全長cDNA，如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，也可為編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或其部分編碼序列，如HA1區(qū)（30-1067bp），或者與SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。在本發(fā)明的疫苗中，調(diào)控EIV囊膜糖蛋白HA基因進(jìn)行表達(dá)的元件包括CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸加尾信號。rAd-XJ3-HA在動物細(xì)胞中并不復(fù)制，但能表達(dá)外源基因HA，其基因組在連續(xù)傳代過程中保持穩(wěn)定。