[發明專利]一種抗GUS蛋白質的單克隆抗體及其應用

在審

• 申請號: 201410009509.2
• 申請日: 2014-01-09
• 公開（公告）號: CN104774267A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 劉國振;尹長城;吳琳;劉斯奇;牛東東;郝育杰;韋漢福;武鵬程;魏健;榮瑞娟
• 申請（專利權）人: 北京華大蛋白質研發中心有限公司
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;G01N33/577;G01N33/573
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本發明涉及一種可特異性識別GUS(β?葡糖苷酸酶)的單克隆抗體的制備方法和其在轉基因生物檢測中的應用方法。目的是提供一種可檢測GUS蛋白質的單克隆抗體和將該抗體用于轉基因植物、動物和細胞等生物體的高靈敏度免疫學檢測方法。GUS蛋白質被廣泛用于基因轉移報告基因，它可催化底物形成β?D?葡萄糖苷酸，傳統方式是以分光光譜、熒光等進行檢測，依賴于酶的活性，易受溫度變化及加工過程的影響，一直以來缺乏一種快速有效、靈敏度高的檢測方法。制備該抗體所用抗原為大腸桿菌表達的可溶性的全長GUS重組蛋白，最終獲得的抗體屬于IgG1a亞型，可以檢測轉基因植物(水稻、棉花、玉米等)、轉基因動物和細胞中存在的GUS蛋白質的表達，從而對轉基因生物做出鑒定。

技術領域

本發明涉及一種可以識別人GUS（β-葡糖苷酸酶）蛋白質的單克隆分子及可分泌該抗體的雜交瘤細胞系。具體而言，本發明提供了一種抗GUS分子的單克隆抗體，對該抗體重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列和編碼可變區的DNA序列進行了確定，該抗體可以用于通過人工或自動化方式，以流式細胞術、免疫組織化學染色（IHC）、酶聯免疫吸附（ELISA）或免疫印跡（Western Blot）方式檢測轉基因植物( 水稻、棉花、玉米等)、動物、細胞及微生物中的GUS蛋白，也可用于含GUS蛋白的生物樣本富集和分離，屬于生物檢測和分析領域。

背景技術

GUS基因編碼β-D-葡萄糖苷酶，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學檢測很穩定，可用分光光譜、熒光等進行檢測，是目前常用的一種報告基因。但這種基于酶活性的檢測方法，易受溫度變化及加工過程的影響。報告基因在基因表達調控和基因工程研究中處于非常重要的地位，它是作為外源目的基因能否轉化生物體的探路先鋒而首先被研究的，在研究植物的基因表達調控方面起著重要的作用，現已應用到真核生物的基因調控領域中。隨著基因工程技術日新月異的發展，報告基因這一探路者的作用會更明顯。

隨著轉基因植物的不斷發展及其商品化的種類不斷增加，轉基因生物本身的安全性以及它們對人類健康和生態環境的潛在威脅成為國際社會和廣大民眾廣泛關注的熱點問題之一。包括我國在內的越來越多的國家制定并實施了轉基因食品的強制標識制度。因此，轉基因產品的科學管理和應用需要得到轉基因產品及其成分檢測技術的支持。

目前，轉基因產品及成分檢測最常用的方法有兩類：一類是針對其外源核酸成分的檢測技術；另一類是針對其外源蛋白質成分的免疫學分析方法。基于DNA 的檢測方法只能在核酸水平上反映轉基因樣品是否含有外源DNA，不能檢測其外源基因是處于沉默還是表達狀態，此類檢測技術對判讀外源蛋白質豐度無指導性意義。對于某些轉基因植物的產品，DNA在加工過程中會降解掉而難以檢測，此時，需要利用免疫分析法來檢測轉基因的組分。基于外源蛋白質的免疫學分析方法，采用高度特異性的抗原抗體反應，實現對轉基因植物樣本快速、準確、高效的檢測，其技術關鍵是制備具有高度特異性的抗體。目前雖有抗GUS兔單克隆抗體制備的報道（沈金兒 倪庚 鄭曉冬，抗β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)兔單克隆抗體的制備和鑒定。中國食品學報，2012，第11期），但該抗體對重組蛋白的檢測限僅為50ng/mL，且并未對轉基因生物進行檢測而驗證其應用能力。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種能針對轉基因植物中常見的GUS蛋白質的廣譜單克隆抗體雜交瘤及其制備方法。

本發明的第二個目的是提供一種特異性好的單克隆抗體的制備方法，該抗體 能特異結合GUS重組抗原和轉基因生物。

本發明的第三個目的是提供一種將本抗體用于以水稻為代表的轉基因生物檢測方法。

本發明的第四個目的是提供一種利用GUS單克隆抗體與抗原的結合能力，完成表達GUS報告基因在轉基因植物、轉基因動物、轉基因微生物、細胞或其他材料中的分選和富集方法。

解決技術問題所采用的技術手段

本發明制備了一株雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的制備方法包括以下步驟：