[發明專利]一種高催化活性的D-阿洛酮糖 3-差向異構酶的突變體酶及其應用

有效

• 申請號: 201410001913.5
• 申請日: 2014-01-03
• 公開（公告）號: CN103710330A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 江波;沐萬孟;賈敏;張濤;黃敏;周榴明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/63;C12R1/145
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明公開一種高催化活性的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶的突變體酶及其應用，屬于酶的基因工程技術領域。

背景技術

D-阿洛酮糖?3-差向異構酶（DPE酶）屬于D-塔格糖?3-差向異構酶（簡稱DTE）家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構，是生產稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨或與其他酶偶聯合成多種碳水化合物，被廣泛的應用于化學、食品和制藥等領域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉化，利用D-果糖生產D-阿洛酮糖。

隨著由過量高能量食物攝入引發的一系列慢性病在世界范圍內的爆發，膳食結構越來越受到人們的關注。新型的蔗糖替代品的開發和研究仍是功能性甜味劑領域具有重要經濟價值和實際意義的當務之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營養和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認定為GRAS食品，允許用于食品和膳食補充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護胰腺β-胰島細胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業中有很大的應用前景。

雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但在其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法制備D-阿洛酮糖是近年來的一個研究熱點。高效的生物催化劑的開發對工業應用至關重要。因此，開發具有高催化活性的DPE酶對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。本實驗室開發的梭狀芽孢桿菌（Clostridium?bolteae）DPE酶可以有效促進D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉化（Min?Jia,?et?al.?2013,?Applied?Microbiology?and?Biotechnology,?DOI?10.1007/s00253-013-4924-8）。但為獲得更適合的生物催化劑，通過定點突變的方法，對DPE酶進行分子改造，進一步提高其催化活性和熱穩定性，以期得到酶學性質更適合工業應用的DPE酶。

發明內容

本發明提供一種高催化活性的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶的突變體酶及其應用，對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。

本發明的技術方案：一種高催化活性的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶DPE的突變體酶Y68I，將來源于梭狀芽孢桿菌（Clostridium?bolteae）ATCC?BAA-613的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶進行突變所得的單突變體酶；將原來DPE基因中第68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸Ile，命名為Y68I。

與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其K_m值降低，k_cat/K_m得到提高。

?K_m，mMKcat，s^-1k_cat/K_m，s^-1 mM^-1野生菌54.4556.101.031Y68I46.0562.74? 1.362．