[發(fā)明專利]確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410001608.6
• 申請(qǐng)日: 2014-01-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104762369A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李子龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李子龍
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/48;C12Q1/02;G01N33/68;G01N33/573
• 代理公司: 沈陽(yáng)亞泰專利商標(biāo)代理有限公司 21107
• 代理人: 韓輝

1.一種確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法，其特征在于有以下步驟：

1.1、建立小鼠急性高血壓模型,以活體麻醉狀態(tài)下，結(jié)扎小鼠左側(cè)腎動(dòng)脈下的腹主動(dòng)脈建立小鼠急性高血壓模型，應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法取材固定左腎組織;

1.2、確定GSK3β/β-catenin信號(hào)通路參與急性高血壓導(dǎo)致足細(xì)胞損害：應(yīng)用免疫組化方法及共聚焦顯微鏡，觀察β-catenin由細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、Cx43、Podocalyxin及細(xì)胞骨架蛋白α-actin-4、Synaptopoin分布關(guān)系，免疫電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用Western?blot、RQ-PCR測(cè)定上述蛋白及mRNA的表達(dá);

1.3、體外培養(yǎng)足細(xì)胞研究GSK3β/β-catenin信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控機(jī)制：體外培養(yǎng)足細(xì)胞，分別給予GSK3β、β-catenin阻斷劑及激動(dòng)劑、PI3K、MAPK阻斷劑及激動(dòng)劑、AngII及ARB等以及模擬缺氧條件，應(yīng)用放射免疫法、直接酶學(xué)方法或Western?blot測(cè)定GSK3β、β-catenin的活性，應(yīng)用熒光染色共定位及Western?blot觀察β-catenin、核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF及靶基因Snail的分布及表達(dá)，；應(yīng)用免疫組化染色及Western?blot研究足細(xì)胞相關(guān)蛋白及骨架蛋白的分布及表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定足細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡;

1.4、活體內(nèi)進(jìn)一步闡明GSK3β/β-catenin信號(hào)通路在急性高血壓足細(xì)胞損害中的啟動(dòng)作用和核心作用：分別預(yù)先給予外源性的GSK3β阻斷劑、β-catenin阻斷劑的急性高血壓小鼠及GSK3β基因敲除、β-catenin基因敲除小鼠，觀察足細(xì)胞GSK3β和β-catenin的活性，及信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白的活性，測(cè)定足細(xì)胞相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白mRNA和蛋白表達(dá)；觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。