[發明專利]用于高效率且高通量產生轉基因事件的改進的分割種子大豆轉化

在審

• 申請號: 201380073296.3
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN105264077A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: D·帕雷迪;S·R·切納雷迪;T·明尼克斯;O·卡爾波娃;D·格里芬;P·S·賈亞庫馬爾;K·史密斯;R·薩里亞-米蘭
• 申請（專利權）人: 美國陶氏益農公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 羅天樂

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年12月19日提交的美國臨時申請61/739,349的優先權，茲將其全文援引并入本申請。

對電子提交的序列表的援引

序列表的正式拷貝作為ASCII格式的序列表通過EFS-Web電子提交，文件名為“73502_ST25.txt”，2013年12月10日生成，大小為19,301字節，并與本說明書同時提交。該ASCII格式文檔中包含的序列表是說明書的一部分，茲將其全部援引并入本申請。

技術領域

本公開涉及一般意義上的植物育種。提供了用于大豆轉化的方法。本公開的方法可用于轉基因大豆的高效率并且高通量的生產，和轉基因大豆產品的產業開發。

背景

大豆(Glycinemax)是最重要的農業作物之一，全世界每年的作物產量超過2億公噸，估計價值超過400億美元。大豆占全球油料種子生產的超過97％。因此，提高這種有價值的作物的質量和產量的可靠而高效的方法具有顯著的利益。

用于改良大豆的傳統育種方法已經受到限制，因為大部分的大豆栽培種僅源于少數幾個親本系，導致種質育種基礎較窄。Christou等，TIBTECH8:145-151(1990)。現時的研究工作主要致力于在用植物基因工程技術來提高大豆產量。轉基因方法旨在將期望的基因導入到作物植物的可遺傳種系中，以產生優良的植物品系。這種策略已經成功地增加了其它幾種作物植物對疾病、昆蟲和除草劑的抗性，同時提高了營養價值。

已經開發出了多種用于將基因轉移到植物組織中的方法，包括高速微噴射、顯微注射、電穿孔和直接DNA攝取。最近，土壤桿菌介導的基因轉化已經被用于將感興趣的基因導入到大豆中。然而已經證明，大豆對轉基因工程而言是一個具有挑戰性的系統。大豆外植體的高效轉化和再生是難以實現的，并且經常難以重復。

根癌土壤桿菌是一種致病性的土棲細菌，具有將其DNA(稱為T-DNA)轉移到宿主植物細胞內、并誘導宿主細胞產生可用于細菌營養的代謝物的固有能力。使用重組技術，可以將一些或全部的T-DNA用感興趣的基因取代，產生可用于轉化宿主植物的細菌載體。土壤桿菌介導的基因轉移通常針對組織培養物中未分化的細胞，但也可以針對從植物葉片或莖獲取的已分化細胞。已經開發了多種用于大豆的土壤桿菌介導的轉化方法，它們可以根據被轉化的外植體組織松散地分類。

美國專利No.7,696,408，Olhoft等人公開了一種子葉節(cotyledonarynode)方法，用于轉化單子葉植物和雙子葉植物。“子葉節”方法涉及從5-7日齡大豆幼苗通過在子葉節的正下方切割除去下胚軸，切開并分離剩余的帶有子葉的下胚軸節段，并從子葉除去上胚軸(epicotyl)。將子葉外植體在腋芽和/或子葉節的區域中造傷口(wounded)，并與根癌土壤桿菌在黑暗中培養五天。該方法需要在體外萌發種子，并且制造傷口步驟(woundingstep)會引入顯著的變數。

美國專利No.6,384,301，Martinelli等人公開了向來自從大豆種子切下的大豆胚的活分生組織中進行土壤桿菌介導的基因傳遞，隨后用選擇劑和激素培養分生外植體，并誘導芽形成。與“子葉節”方法相似，優選地在感染之前對分生外植體致傷。

美國專利No.7,473,822，Paz等人公開了一種改良的子葉節方法，稱作“半種子外植體”法。使成熟的大豆種子吸脹，表面滅菌，并沿著種臍切開。在感染之前，胚軸和芽被完全除去，但沒有其它的傷口出現。進行土壤桿菌介導的轉化，選擇潛在轉化體，并在選擇培養基上再生外植體。

使用這些方法的轉化效率仍然相對較低，“子葉節”法在0.3％-2.8％的量級，“分生外植體”法為1.2-4.7％，“半種子外植體”法為3.2％-8.7％(整體4.9％)。本領域的典型轉化效率為大約3％。

改良的“分割種子”轉基因程序可以加速未來轉基因大豆產品的生產和開發。用于將轉基因穩定整合到大豆組織中的高效且高通量的方法將促進育種進程，并具有提高作物的產量的潛力。

公開概要

本公開涉及轉化植物細胞的方法。更具體地，本公開涉及用于轉化大豆(Glycinemax)的方法，其使用土壤桿菌介導轉化分割的(split)大豆種子，其中分割的大豆種子保留一部分胚軸。