[發明專利]納米金剛石顆粒及其制造方法以及熒光分子探針和蛋白質的結構分析方法

在審

• 申請號: 201380064943.4
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN104870365A
• 公開（公告）日: 2015-08-26
• 發明（設計）人: 白川昌宏;外間進悟;五十嵐龍治;原田慶恵
• 申請（專利權）人: 國立研究開發法人科學技術振興機構
• 主分類號: C01B31/06
• 分類號: C01B31/06;G01N21/64;G01N24/00
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

技術領域

本發明涉及納米金剛石顆粒及其制造方法以及熒光分子探針和蛋白質的結構分析方法。

背景技術

作為蛋白質的結構、蛋白質等生物分子的結構分析、功能分析中使用的熒光分子探針，已知有各種探針。例如，可列舉出與伯胺發生特異性反應而表現出熒光性的熒光胺等。此外，通過利用熒光分子探針標記靶蛋白質并使用熒光顯微鏡等進行觀測，從而能夠收集靶蛋白質的運動、取向等之類的與分子結構相關的各種信息。此外，最近，作為這種熒光分子探針所使用的熒光物質，納米金剛石顆粒受到關注(例如，日本特開2011-180570號公報(專利文獻1))。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2011-180570號公報

發明內容

發明要解決的問題

在生物體內，蛋白質密切參與生命現象。此外，追蹤蛋白質在生物體內的結構變化在揭示蛋白質的功能、乃至揭示疾病的表現、進展的機理上極其重要。一直以來，蛋白質的結構分析僅在“體外(in-vitro)”即試管內進行。但是，實際上蛋白質發揮功能的生物體內“in-vivo”與試管內相比，環繞蛋白質的環境大大不同，因此試管內觀測到的結果能夠直接應用于生物體內的結構、功能的情況有限，期望盡快建立生物體內的蛋白質的結構分析方法。

一直以來，蛋白質的結構分析中主要使用基于核磁共振的分子結構分析法〔以下也記作“NMR(Nuclear?Magnetic?Resonance)法”〕、利用熒光顯微鏡的熒光分子觀察法等。

NMR法由于能夠進行非侵入性的測量，并且具有原子級別的高空間分辨率，因此能夠收集與立體結構相關的許多信息。然而，在另一方面，靈敏度低，時間分辨率也低，因此難以進行實時的觀測。

熒光分子觀察法能夠進行一分子測量，并且能夠進行實時觀察/測量。然而，在另一方面，空間分辨率低，極難測量所謂結構的波動、結構變化。進而，熒光分子探針所使用的熒光物質也常常具有毒性，不適于非侵入性的測量。

如此，利用現有的方法，在生物體內非侵入性且實時地觀測1分子蛋白質的結構變化是不可能的。

已知光檢測磁共振法〔以下也記作“ODMR(Optically-Detected?Magnetic?Resonance)法”〕作為高靈敏度地檢測試驗體的磁共振的手段。ODMR法通過對試驗體同時照射激發光和高頻磁場并檢測熒光發光量的變化，從而高靈敏度地檢測磁共振。在此之后，本說明書中也將這種測量手段記作ODMR測量。

近年來，正在進行例如像專利文獻1中記載的熒光顯微鏡裝置那樣將融合磁共振法和熒光分子觀察法而成的ODMR法應用于生物體內的蛋白質的結構分析的研究。于是，其中顯示出納米金剛石顆粒作為熒光分子探針的可能性。

已知，包含由金剛石晶體中的氮原子和空穴構成的復合缺陷(以下也記作“NV色心”)的納米金剛石顆粒在NV色心發生熒光發光，并且因磁共振而使熒光發光量變化。此處，NV色心表示如圖1所示由取代了金剛石晶體中的碳原子1的氮原子2(N；Nitrogen)和與氮原子2相鄰的空穴3(V；Vacancy)構成的復合缺陷。

關于NV色心的熒光，熒光的褪色、閃爍較少，向熒光分析的適應性高。進而，納米金剛石顆粒為包含碳原子的物質，因此認為其對生物體的毒性極低，而且用于標記靶蛋白質的顆粒表面的化學修飾容易，因此作為在生物體內使用的熒光分子探針被視為有前景。

進行包含如上所述的NV色心的納米金剛石顆粒的ODMR測量，以將熒光發光量作為縱軸、磁場頻率作為橫軸的二維坐標表示時，在特定的高頻磁場中觀測到熒光發光的減少峰。此處，本說明書中，也將以上述二維坐標表示的譜圖記作“ODMR譜”，也將上述減少峰記作“ODMR信號”。

此外，ODMR測量中，將照射高頻磁場時的發光量設為L(ON)、未照射磁場時的發光量設為L(OFF)時，將根據下述式(I)算出的熒光發光量的減少率定義為“ODMR強度”。

(ODMR強度)＝1-{L(ON)/L(OFF)}…(I)

上述減少峰(ODMR信號)在放置于靜態的外部磁場中的NV色心發生分裂，峰的分裂寬度隨NV色心的旋轉運動而變化，因此，通過使用包含NV色心的納米金剛石顆粒作為熒光分子探針，利用該熒光分子探針標記靶蛋白質，并且測量ODMR譜，從而有可能實現依靠上述現有方法無法實現的生物體內的蛋白質的精細且實時的結構分析。