[發明專利]用于具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的生產方法有效

申請號：	201380058019.5	申請日：	2013-09-06
公開（公告）號：	CN104781413B	公開（公告）日：	2018-01-23
發明（設計）人：	申珍煥;樸萬勛;金勛;盧明柱;樸秀真	申請（專利權）人：	SK化學公司
主分類號：	C12P19/04	分類號：	C12P19/04;C12N1/20;C12R1/46
代理公司：	北京康信知識產權代理有限責任公司11240	代理人：	張英,宮傳芝
地址：	韓國***	國省代碼：	暫無信息
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摘要：
搜索關鍵詞：	用于具有肺炎球菌血清莢膜多糖生產方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生產具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的方法，更具體地，涉及通過從產生肺炎球菌血清型的細菌細胞的發酵液(培養肉湯，culture broth)中除去雜質如蛋白和核酸生產具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的方法。

背景技術

肺炎球菌(肺炎鏈球菌)是屬于家族鏈球菌科的革蘭氏陽性菌，屬于乳酸菌綱，并且它會在人類中引起疾病如肺炎、菌血癥、中耳炎和腦膜炎。肺炎球菌血清型的細胞具有莢膜，其是圍繞各個細胞的多糖涂膜。該莢膜通過防止抗體附著到細菌細胞上從而干擾吞噬作用?；诿庖邔W特性，該細胞已分類為超過90種血清型，據報道其中一些引起侵襲性疾病。從1996年至2008年間收集的侵襲性鏈球菌性肺炎識別了總計有37種血清型，和以以下順序出現的主要的血清型19F>23F>19A>6A>3>9V>6B占了大多數53.4％。這些肺炎球菌血清型的莢膜多糖已經用于生產疫苗如多糖疫苗和多糖-蛋白結合疫苗。

用于生產多糖疫苗和多糖-蛋白結合疫苗的莢膜多糖由生產相應血清型的細菌細胞的發酵液獲得。各種菌株在最佳溫度、pH和攪拌下培養，直到其達到最大密度。為獲得并不是細胞質之外分泌的肺炎球菌莢膜多糖，使用裂解劑如脫氧膽酸鈉(DOC)進行細胞裂解。當細胞被裂解時，連同莢膜多糖釋放出菌株的各種蛋白和核酸，并且它們必須通過后培養純化過程除去。疫苗接種后，為了最小化由任何非抗原物質引起的不良事件的風險，對于蛋白和核酸含量有嚴格的規定。例如，在Prevnar 7^TM的情況下，基于干重，每種血清型中蛋白和核酸分別滿足2％至5％或更低以及1％至2％或更低的規定。

國際專利公開號WO 2006/110352公開了一種生產莢膜多糖的方法，包括肺炎鏈球菌的培養、細胞裂解，通過將細胞裂解液酸化至小于5.5的pH蛋白沉淀、不攪拌孵育和離心和/或過濾。此外，國際專利公開第WO 2008/118752號公開了通過進行細胞裂解液的超濾和滲濾以及隨后通過經由酸化的蛋白沉淀過程生產莢膜多糖的方法。然而，所有這些相關的生產方法需要通過用pH調節劑酸化的蛋白沉淀過程，這使得整個過程變得復雜并且還導致莢膜多糖改性并產生有害物質。

發明內容

技術問題

本發明人已經進行了各種研究以改進生產具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的方法。令人驚訝地，本發明人發現當在不調節pH的情況下在相同的條件下進行另外的培養時，通過來自培養的產物(尤其是乳酸等)可以將pH降低至適合蛋白沉淀的范圍，即pH 5.5。也就是說，本發明人發現，通過在沒有pH調節的情況下進行另外的培養可以去除通過用pH調節劑酸化的蛋白沉淀過程，并且隨后進行細胞裂解和蛋白沉淀過程。

因此，本發明的目的是提供生產具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的改進的方法。

技術方案

根據本發明的一方面，提供了生產具有肺炎球菌血清型的莢膜多糖的方法，包括以下步驟：

(a)培養產生肺炎球菌血清型的細菌細胞，同時將發酵液的pH保持在7.0至9.4的范圍；

(b)在發酵液的吸光度保持恒定至吸光度開始下降之間的時刻終止步驟(a)的培養；

(c)在不調節pH的情況下對獲得自步驟(b)的發酵液進行另外的培養直到發酵液的pH達到5.5或更低的pH；

(d)將裂解劑加入獲得自由步驟(c)的發酵液以裂解細胞，沉淀蛋白，并除去沉淀的蛋白和細胞碎片以得到澄清的細胞裂解液；和

(e)從獲得自步驟(d)的裂解液中分離并純化莢膜多糖。

在本發明的生產方法中，肺炎球菌血清型可以是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。

步驟(a)的培養可以在50至150轉/分的攪拌下在34至38℃進行。

在本發明的實施方式中，可以通過從發酵液的吸光度保持恒定的時刻1至3小時內終止步驟(a)的培養進行步驟(b)。

步驟(c)的另外的培養可以在不調節pH的情況下在34至38℃在50-150轉/分的攪拌下進行。