[發明專利]使用小分子從多能干細胞產生胰內胚層

有效

• 申請號: 201380045948.2
• 申請日: 2013-09-03
• 公開（公告）號: CN104903440B
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: J.埃克伯格;M.漢斯森;U.多恩;K.赫斯;N.富納
• 申請（專利權）人: 諾和諾德股份有限公司;寶生物工程歐洲股份公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 黃登高,徐厚才

技術領域

本發明涉及從多能干(PS)細胞例如人定形內胚層產生胰內胚層的方法。

發明背景

β細胞移植潛在地提供了I型糖尿病的最終治療。然而，供體β細胞有限的可用性制約了該治療作為臨床治療的用途。多能干細胞可無限增殖和分化為多種細胞類型；因此，PS細胞為有希望的β細胞來源。然而，在PS細胞可用于治療糖尿病前，其需要有效和可再生地分化為胰細胞。

在脊椎動物胚胎發育期間，多能細胞產生三個胚層：外胚層、中胚層和內胚層。對于形成內胚層衍生組織，定形內胚層(DE)的誘導是第一步；從DE細胞產生胰內胚層(PE)為產生產胰島素的β細胞所必需的。具有成為內分泌祖細胞(EP)潛能的PE細胞特征在于兩個重要轉錄因子PDX1和NKX6.1的共表達。

對于從PS細胞產生胰細胞已經建立了分步體外分化方案。這些方案一般模擬胰發育的主要事件，其包括幾個階段例如共表達SOX17和FOXA2的DE、原腸、后前腸、PE、EP和最后成熟β細胞的形成。迄今為止，hES細胞的有效DE分化已通過激活蛋白A處理實現。產生胰β細胞的下一個主要步驟為產生共表達PDX1和NKX6.1的PE。已開發出幾組可將PS細胞分化為DE和PE的體外方案，然而其僅能產生中等分數的NKX6.1/PDX1雙陽性(db +ve)細胞，而且重要的是其中無一能夠體外產生完全成熟的β細胞(Cai等(2010); D’Amour等(2006); Kunisada等(2012); Schulz等(2012); Zhang等(2009); Ameri等(2010))。

概述

本發明涉及產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將定形內胚層(DE)細胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一種化合物：

a. BMP抑制劑LDN-193189 (在表1中列出)

b. 激酶抑制劑(在表1和表2中列出)

c. 視黃酸受體激動劑(在表2中列出)，

以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。

本發明進一步涉及用于產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將DE細胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一種化合物：

a. BMP抑制劑LDN-193189 (在表1中列出)

b. 具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的異構體(在表1和2中列出)

c. 視黃酸受體激動劑(在表2中列出)，

以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體(pancreatic or pancreatic cell precursors)。

本發明進一步涉及用于產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將定形內胚層細胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一種化合物：

a. BMP抑制劑LDN-193189

b. JNK抑制劑II

c. AM580，

以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。

本發明進一步涉及用于產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將定形內胚層細胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189，以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。

本發明進一步涉及用于產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將DE細胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189，并隨后暴露于下列分子之一，

a. Wnt抑制劑IWP2

b. Hedgehog抑制劑環巴胺(Cyclopamine, Cyc)

以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。

本發明進一步涉及用于產生胰細胞或胰細胞前體的方法，其中至少5%的細胞共表達PDX1和NKX6.1，包括將DE細胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189，并隨后暴露于JNK抑制劑II、視黃酸或視黃酸衍生物、bFGF和下列分子之一的組合：

a. Wnt抑制劑IWP2

b. Hedgehog抑制劑環巴胺

以使人DE細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。