[發明專利]熒光融合多肽、包含所述多肽的生物感應器及其用途

有效

• 申請號: 201380045944.4
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN104781667B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 丹尼爾·科塔薩爾-薩巴拉;艾達-克拉麗莎·薩拉多-波貢扎;喬治·加米斯-馬塔;梅瑞特謝爾·羅拉-費勒;羅莎·麥拉-洛佩斯;帕特麗夏·維拉斯-洛扎諾
• 申請（專利權）人: 生物系統技術創新公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 黎艷,萬志香

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其是熒光融合多肽、包含所述多肽的生物感應器及其用途。

背景技術

以下背景探討僅用于促進讀者對本發明的理解，并不應理解為描述或構成本發明的現有技術。

基于細胞體系的高容量篩選(HCS)使用活細胞作為生物研究工具，用于說明正常細胞和患病細胞的活動。HCS還用于發現和優化新備選藥物。

高容量篩選是現代細胞生物學及其分子工具與自動化高解析度顯微鏡和機器人操作的結合。首先，令細胞接觸化學試劑或RNAi試劑。然后，使用圖像分析來檢測細胞形態改變。使用各種技術，例如與內源蛋白融合的綠色熒光蛋白或熒光抗體，來測定細胞合成蛋白量的改變。

在細胞尺度上并行采集不同細胞性質的數據，例如信號級聯傳導活動和細胞谷歌完整性，是該方法的主要優勢，與之相比，高通量篩選較快，但不夠詳細。雖然HCS相比較慢，但所得的豐富數據允許對藥物作用的理解更深刻。在此意義上，HCS獲取信號級聯轉導活動相關數據的目的之一，在于通過測量胞內第二信使水平，來測定不同藥物在信號傳導過程中的作用。

第二信使是從細胞表面的受體處接力將信號傳遞給細胞內細胞質或細胞核中的目標分子。他們接力傳導荷爾蒙信號(例如腎上腺素、生長因子等)并引起細胞活動的某些改變。他們極大地放大信號強度。第二信使是信號級聯轉導的參與者之一。這些第二信使中，cAMP和鈣是第二信使概念的范例，且被認為是普遍存在并調控許多細胞內關鍵過程的關鍵胞內分子。

理想狀態下，所述測量要求精確定位、高動態范圍的、以及盡可能少的細胞生理學干擾的工具，其能夠使用高容量篩選方法來監控體內第二信使水平。

基于此，產生了各種基于熒光性質動態變化的熒光生物感應器。在此意義上，所述生物感應器種類通常基于熒光共振能量轉移(FRET)的改變。FRET是能量通過非輻射的偶極到偶極的偶聯，從激發的供體熒光團轉移到受體熒光團的過程。該能量傳遞的效率高度依賴于供體和受體熒光團之間的距離(例如，對CFP/YFP而言<10nm)和相對方向。但是，高容量篩選方法中，基于FRET的生物感應器要求至少具有4個過濾器的探測設備，其中2個用于激發，2個用于發射。此外，由于探測信號的強度低，探測信號范圍和篩選敏感性也低。最后，使用大于1個熒光發射信號，要求使用更多算法以正確地分析最終信號。

因此，仍存在開發用于在活細胞動態環境中實時測量第二信號濃度的改進方法。

發明內容

本發明的第一個方面，涉及一種熒光融合多肽，能夠在細胞質中的第二信使濃度增加時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包含膜定位肽、第二信使轉導蛋白結合肽、內質網滯留信號和熒光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述熒光融合多肽的N端，且物理性地連接在所述熒光肽上，可選地，所述連接是通過連接子；而所述熒光肽物理性地連接在所述第二信使轉導蛋白結合肽上，可選地，所述連接是通過連接子；以及

b.所述第二信使轉導蛋白結合肽物理性地連接在所述內質網滯留信號上，可選地，所述連接是通過連接子，而所述內質網滯留信號位于所述熒光融合多肽的C端。

在本發明第一方面的另一個優選實施例中，所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白細胞介素-2受體的胞外域，或根據氨基酸同源性與所述序列整個區域具有至少90％同源性的變體；以及，所述內質網滯留信號是選自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X為任意氨基酸，且優選地，所述內質網滯留信號是KDEL。

本發明第一方面的更優選實施例中，所述第二信使轉導蛋白結合肽是cAMP轉導蛋白結合多肽、鈣轉導蛋白結合多肽、IP3轉導蛋白結合多肽、cGMP轉導蛋白結合多肽或甘油二脂轉導蛋白結合多肽。因此，在本發明的一個更優選的實施例中，本發明第一方面的熒光融合多肽能夠在細胞質中的第二信使濃度增加時將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，且所述第二信使選自：鈣、IP3、cAMP或甘油二酯。本發明的第二方面中，涉及一種熒光融合多肽，所述多肽能夠在胞內鈣濃度增加時，將自己在細胞中的定位從細胞質膜轉移至滯留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含鈣調素結合序列的第二信使轉導蛋白結合肽、內質網滯留信號和熒光肽，其中：