[發明專利]確定細胞樣品中靶核酸存在或不存在的方法

在審

• 申請號: 201380045609.4
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN104583423A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: M·斯普林格-豪瑟斯;C·庫普弗;P·沙茨
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

1.一種測定細胞樣品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)將含有陰離子交換部分的表面與樣品在適合于誘導所述細胞和所述表面之間結合的條件下接觸；

b)將含有結合細胞的表面與剩余樣品分離以收集細胞；

c)從細胞釋放核酸；

d)在靶核酸和靶核酸的特異性探針之間形成雜交體；和

e)檢測所述雜交體的存在或不存在。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟d)之前不分離含有陰離子交換部分的表面。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有陰離子交換部分的表面具有至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或所有的以下特征：

i.所述陰離子交換部分包含胺基；

ii.所述表面包含聚乙烯亞胺作為陰離子交換部分；

iii.所述陰離子交換部分耐受步驟d)中所用條件下的降解；

iv.所述表面由顆粒提供；

v.所述表面由磁性顆粒提供；

vi.所述表面由平均尺寸為5μm或更低、3μm或更低、2μm或更低和1.5μm或更低的顆粒提供；和/或

vii.所述表面由在顆粒表面包含羧基的磁性顆粒提供，其中至少一部分所述羧基用聚乙烯亞胺官能化以提供陰離子交換部分。

4.如權利要求1-3中一個或多個所述的方法，其特征在于，在細胞樣品中，細胞包含在液體介質，優選液基細胞學介質中。

5.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于，包含陰離子交換部分的表面由磁性顆粒提供，其中在所述磁性顆粒與樣品接觸后，所述磁性顆粒在得到的混合物中的濃度選自：50μg/ml-2000μg/ml、75μg/ml-1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml-1250μg/ml和150μg/ml-1100μg/ml。

6.如權利要求1-5中一個或多個所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，細胞結合發生在選自3-8.5、3.5-8.0、3.5-7.75、3.5-7.5、3.5-7.25或3.75–7的pH范圍的pH值下。

7.如權利要求1-6中一個或多個所述的方法，其特征在于，在步驟c)中，所收集的陰離子交換表面結合細胞與促進核酸從所述細胞釋放的液體組合物接觸，其中，任選地，在步驟c)中進行加熱步驟以促進核酸的釋放和/或變性。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述液體組合物具有一種或多種，優選至少兩種、至少三種和更優選所有的以下特征i到v：

i.它包含一離液劑；

ii.它具有堿性pH值；

iii.它具有的pH值選自：pH?12或更高、pH?12.5或更高、pH?13或更高、或pH?13.25或更高；

iv.它包含一種或多種添加劑，優選

aa)螯合劑；

bb)緩沖劑；和/或

cc)防腐劑

v.所述液體組合物通過混合兩種或多種組合物獲得，其中所述組合物之一包含離液劑，和所述組合物之一是包含堿性試劑的堿性溶液。

9.如權利要求1-8中一個或多個所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換表面由包含聚乙烯亞胺作為陰離子交換部分的磁性顆粒提供，其中，所述磁性顆粒不在步驟c)和d)之間除去。

10.如權利要求1-9中一個或多個所述的方法，其特征在于，進行雜交體捕獲測定，其中步驟d)和e)包括以下步驟：

步驟d)

-在允許探針與單鏈靶核酸分子進行雜交形成雙鏈核酸雜交體的條件下，將含有釋放且變性的核酸的樣品與一種或多種的靶核酸特異性探針接觸，其中，優選形成RNA/DNA雜交體；

-利用結合雙鏈核酸雜交體的結合劑捕獲所述雙鏈核酸雜交體；

-任選地將所述雙鏈核酸雜交體與未結合的核酸分離；

步驟e)

-檢測雙鏈核酸雜交體的存在或不存在，藉此表明所述靶核酸的存在或不存在。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述表面由磁性顆粒提供，其中所述磁性顆粒存在于所述雜交體的生產和捕獲期間并且不在步驟d)中借助磁體除去，而是在進行檢測步驟e)之前、在分離剩余樣品和/或進行一個或多個洗滌步驟時除去。