[發明專利]用于RNA定向的靶DNA修飾和用于RNA定向的轉錄調節的方法和組合物

有效

• 申請號: 201380038920.6
• 申請日: 2013-03-15
• 公開（公告）號: CN104854241B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: J·A·多德納;M·金內克;K·凱林斯基;埃瑪紐埃爾·沙爾龐捷;J·H·多德納凱特;W·利姆;亓磊
• 申請（專利權）人: 埃瑪紐埃爾·沙爾龐捷;加利福尼亞大學董事會;維也納大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C07K19/00;C12N5/10
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

1.一種修飾靶DNA的方法，所述方法包括使所述靶DNA與復合物接觸，所述復合物包含：

(a) Cas9多肽，以及

(b) 單分子靶向DNA的RNA，其包含：

(i) DNA靶向區段，其包含與所述靶DNA中的序列互補的核苷酸序列；和

(ii) 蛋白質結合區段，其與所述Cas9多肽相互作用，其中所述蛋白質結合區段包含雜交以形成雙鏈RNA(dsRNA)雙鏈體的兩個互補核苷酸段，

其中所述dsRNA雙鏈體包含tracrRNA和CRISPR RNA（crRNA）的互補核苷酸，

其中所述兩個互補核苷酸段是通過插入核苷酸共價連接，

其中所述接觸為體外的或在離體細胞內；以及

其中所述修飾為裂解所述靶DNA。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述dsRNA雙鏈體的長度為8個堿基對(bp)至30 bp。

3.如權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質結合區段的雜交以形成dsRNA雙鏈體的核苷酸之間的互補百分比為70%以上。

4.如權利要求2所述的方法，其中所述蛋白質結合區段的雜交以形成dsRNA雙鏈體的核苷酸之間的互補百分比為70%以上。

5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶DNA存在于細菌細胞、古細菌細胞、單細胞真核生物、植物細胞、無脊椎動物細胞或脊椎動物細胞中。

6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶DNA為染色體DNA。

7.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述接觸包括將以下引入細胞：(a) 所述Cas9多肽或編碼所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或編碼所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

8.如權利要求5所述的方法，其中所述接觸包括將以下引入細胞：(a) 所述Cas9多肽或編碼所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或編碼所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

9.如權利要求6所述的方法，其中所述接觸包括將以下引入細胞：(a) 所述Cas9多肽或編碼所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或編碼所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

10.如權利要求7所述的方法，其中所述方法還包括將供體多核苷酸引入到所述細胞中。

11.如權利要求8所述的方法，其中所述方法還包括將供體多核苷酸引入到所述細胞中。

12.如權利要求9所述的方法，其中所述方法還包括將供體多核苷酸引入到所述細胞中。

13.如權利要求1-4和8-12中任一項所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域共價連接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

14.如權利要求5所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域共價連接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

15.如權利要求6所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域共價連接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

16.如權利要求7所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域共價連接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

17.如權利要求1-4和8-12中任一項所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域連接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

18.如權利要求5所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域連接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。

19.如權利要求6所述的方法，其中將蛋白質轉導結構域連接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白質轉導結構域促進所述Cas9多肽從胞質橫穿到細胞的細胞器中。