[發明專利]利用編碼包含BCN基團的氨基酸的正交密碼子和正交PylRS合成酶將包含BCN基團的氨基酸整合到多肽中的方法

在審

• 申請號: 201380037290.0
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN104718285A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 賈森·欽;凱瑟琳·郎
• 申請（專利權）人: 醫藥研究委員會
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/55
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 付文川;王芝艷

1.一種多肽，其包含具有雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)基團的氨基酸。

2.如權利要求1所述的多肽，其中所述BCN基團作為賴氨酸的殘基存在。

3.一種制備包含BCN基團的多肽的方法，所述方法包括將包含BCN基團的氨基酸遺傳整合到多肽中。

4.如權利要求3所述的方法，其中制備多肽包括：

(i)提供編碼多肽的核酸，該核酸包含編碼具有BCN基團的氨基酸的正交密碼子；

(ⅱ)在識別所述正交密碼子的正交tRNA合成酶/tRNA對存在的情況下翻譯所述核酸，并將所述具有BCN基團的氨基酸整合到多肽鏈上。

5.如權利要求3或權利要求4所述的方法，其中所述包含BCN基團的氨基酸是BCN賴氨酸。

6.如權利要求4所述的方法，其中所述正交密碼子包括琥珀密碼子(TAG)，所述tRNA包括MbtRNACUA，所述具有BCN基團的氨基酸包含雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)賴氨酸和所述tRNA合成酶包含具有突變Y271M、L274G和C313A(BCNRS)的PylRS合成酶。

7.如權利要求1或權利要求2所述的多肽或如權利要求3至6任一項所述的方法，其中所述具有BCN基團的氨基酸整合于對應于野生型多肽上的賴氨酸殘基的位置上。

8.如權利要求1、2或7任一項所述的多肽，其包括單個BCN基團。

9.如權利要求1、2、7或8任一項所述的多肽，其中所述BCN基團連接到四嗪基團上。

10.如權利要求9所述的多肽，其中所述四嗪基團進一步連接到熒光團上。

11.如權利要求11所述的多肽，其中所述熒光團包括熒光素、四甲基羅丹明(TAMRA)或硼吡咯甲烷(BODIPY)。

12.一種氨基酸，其包括雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)。

13.如權利要求12所述的氨基酸，其是雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)賴氨酸。

14.如權利要求13所述的BCN賴氨酸，其具有以下結構：

15.一種制備包括四嗪基團的多肽的方法，所述方法包括提供如權利要求1、2、7或8任一項所述的多肽，將所述多肽與四嗪化合物接觸，并孵育以允許通過反電子需求Diels-Alder環加成反應將四嗪連接到BCN基團上。

16.如權利要求15所述的方法，其中四嗪選自圖1的6至17。

17.如權利要求15所述的方法，其中四嗪選自圖1的6、7、8和9，并且反應的準一級速率常數為至少80M^-1s^-1。

18.如權利要求15至17任一項所述的方法，其中允許所述反應進行10分鐘或更少。

19.如權利要求18所述的方法，其中允許所述反應進行1分鐘或更少。

20.如權利要求19所述的方法，其中允許所述反應進行30秒或更少。

21.如權利要求15至20任一項所述的方法，其中所述四嗪化合物是選自由圖1的11和17組成的組的四嗪化合物。

22.一種PylRS?tRNA合成酶，其包括突變Y271M、L274G和C313A。

23.一種基本上如本文所述的化合物、多肽或方法。

24.一種基本上參考附圖所述的化合物、多肽或方法。