[發明專利]活性染色方法

有效

• 申請號: 201380035736.6
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN104662425B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 埃里克·斯廷普森
• 申請（專利權）人: 查爾斯河實驗室公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 北京泛誠知識產權代理有限公司11298
• 代理人: 吳立,文琦

相關申請的交叉引用

本申請要求2012年5月2日提交的共同未決的美國臨時專利申請號61/641,805和2013年3月14日提交的共同未決的美國臨時專利申請號61/784,759的優先權和權益，將各申請的全部內容通過引用結合在此。

發明領域

本發明總體上涉及檢測細胞樣品中的活細胞的系統和方法，并且特別涉及使用可透過膜的滲透活細胞和非活細胞兩者的熒光標記物以及不可透過膜的選擇性地滲透非活細胞的淬滅劑來檢測細胞樣品中的活細胞的系統和方法。

背景

例如由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、以及真菌(例如酵母菌和霉菌)造成的微生物污染可以導致嚴重的疾病，并且在一些情況下甚至導致人類和動物受試者中的死亡。在某些產業例如食品、水、化妝品、制藥、以及醫療器械產業中的生產商必須符合嚴格的標準驗證他們的產品不包含一定水平的微生物污染物，否則會損害消費者或接受者的健康。這些產業需要針對微生物污染物的存在進行頻繁的、準確的、和靈敏的測試，以符合某些標準，例如由美國食品與藥品管理局或美國環境保護局規定的標準。

取決于情況，區分活細胞與非活細胞的能力還可以是重要的。例如，在藥物制劑和生物制劑的生產期間，重要的是在生產過程中使用的水是無菌的并且不含污染物。并且，重要的是在藥物(例如，液體藥物制劑和生物劑型，例如可注射的劑型)中包含的水以及例如經由非腸胃外途徑給予至受試者的液體(例如，鹽水)也是無菌的并且不含污染物。在另一方面，在飲用水中一些活微生物的存在可以被接受為直到達到一個點。為了適于飲用，飲用水必須符合嚴格標準。即使微生物可以存在于供水中，該水可依然對于人類消費來說是可接受的。然而，一旦細胞數超過一個閾值水平，該水可能不再被視為對人類消費是安全的。并且，在某些食物產品(例如，生鮮產品)和飲品(例如，牛奶)中某些預定水平的微生物的存在可以是可接受的。然而，一旦已經超過那些水平，食物或飲品可被視為已經變質并且對于人類消費不再是適當的和/或安全的。

用于評估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的傳統的細胞培養方法可以耗費幾天來進行，這取決于測試針對的微生物。在此期間，存在懷疑的產品(例如，食物、飲品、或醫療產品)可以被檢疫隔離，直至結果獲得并且產品可以釋放。因此，存在一種快速檢測(例如，在數小時之內或更短)樣品中的微生物污染物特別是活的微生物污染物的存在和/或量的系統和方法的需求。

概述

本發明部分地是基于可以用于選擇性地標記包含細胞的樣品中的活細胞(例如，原核細胞或真核細胞)的染色方法的發現。該染色方法可以與一種細胞捕獲系統和/或光學檢測系統組合使用以檢測細胞樣品中活細胞的存在。可替代地，該染色程序可以用于對布置于液體內和/或固體支撐物上(例如，在顯微鏡載玻片上，或培養皿、微量滴定板或吸收池中)的活細胞進行染色。并且，該染色程序可以用于對溶液中的細胞進行熒光標記(例如，在流式細胞術之前)。該染色方案可以用于一種用以測量感興趣的特定樣品的生物負載(例如，用以測量一種樣品中的活細胞(例如，活的微生物，如細菌、酵母菌、以及真菌)的數目和/或百分比和/或分數)的方法中。

在一方面，本發明提供了檢測細胞樣品中的活細胞的方法。該方法包括將該細胞樣品中的細胞(i)在允許一種可透過膜的熒光染料滲透活細胞與非活細胞兩者的條件下，暴露于該熒光染料，并且(ii)在允許一種不可透過膜的熒光淬滅劑選擇性地滲透非活細胞而不是活細胞的條件下，暴露于該淬滅劑，該淬滅劑能淬滅由該熒光染料產生的熒光。例如，該淬滅劑選擇性地滲透非活細胞而不是活細胞。此后，該方法包括將細胞暴露于光，例如一束具有一個波長的能夠激發熒光染料產生熒光發射的光，并且用一個檢測器對來自細胞的熒光發射(如果有的話)進行檢測，由此檢測細胞樣品中的活細胞。在選擇的檢測條件下，與活細胞內的熒光染料相比，在非活細胞內的熒光染料發射顯著更少的熒光。因此，與活細胞相比，非活細胞發射顯著更少的熒光。

在某些情況下，例如，當淬滅劑能夠產生熒光發射時，激發光的波長可以被選擇為對該淬滅劑不進行光激發或基本上不進行光激發。可替代地，這種或這些檢測器可以被選擇和/或配置為優先檢測來自染料的發射事件而非來自淬滅劑的發射事件。